重組蛋白原核表達(dá)服務(wù)

重組蛋白表達(dá)服務(wù) — 原核表達(dá)
大腸桿菌（E.coli）重組蛋白表達(dá)技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)變得非常成熟。但如果要在大腸桿菌表達(dá)體系獲得不錯(cuò)的可溶以及高產(chǎn)量的蛋白表達(dá)，一個(gè)優(yōu)秀的表達(dá)策略必不可少。卡梅德生物科技的專家團(tuán)隊(duì)在蛋白表達(dá)和抗體制備方面具有豐富的經(jīng)驗(yàn)和知識儲備，針對每位客戶的需求，我們的都會提供具體的方案設(shè)計(jì)。為了保證重組蛋白的高效以及有活性表達(dá)，通常會涉及以下幾方面的內(nèi)容：

問題1：宿主體系選擇
卡梅德生物會根據(jù)客戶的要求選擇不同的表達(dá)宿主：細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和單細(xì)胞藻類。每一種表達(dá)宿主都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。例如，大腸桿菌等原核表達(dá)體系并不適用于需要表達(dá)的蛋白具有真核的翻譯后修飾（糖基化修飾）。大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)如下：

（1）菌體繁殖速度快：20分鐘倍增一次，這意味著按照1/100的比例接種（MOI），只需幾個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基細(xì)菌即可到達(dá)穩(wěn)定期；
（2）容易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)：理論培養(yǎng)密度是1 × 10¹³ cells/ml，實(shí)際培養(yǎng)過程中使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)大腸桿菌，<1 × 10¹⁰cells/ml。在低溫（11℃）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，細(xì)菌個(gè)數(shù)幾乎不增長。
（3）轉(zhuǎn)染外源DNA容易，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高。

問題2：表達(dá)質(zhì)粒體系選擇
目前最為常用的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體融合了復(fù)制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標(biāo)簽(selection marker)、多克隆位點(diǎn)（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，如圖所示：

復(fù)制子：包含復(fù)制起始點(diǎn)及相關(guān)順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇合適的質(zhì)粒載體時(shí)，質(zhì)?？截悢?shù)應(yīng)當(dāng)是需要我們考慮的一個(gè)重要參數(shù)?？返律飺碛袔讉€(gè)常用的載體系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個(gè)菌體中通常含有15-60 copies；pUC系列含有一個(gè)突變版本的pMB1起始子，在該系列的載體在單個(gè)細(xì)菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達(dá)體系，如FRET系統(tǒng)，該系列含有p15A起始子，單個(gè)細(xì)胞含有10-12個(gè)copies；pSC101系列載體單個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)通常<5個(gè)，常被用于三種蛋白的共表達(dá)。結(jié)合這些質(zhì)粒的特點(diǎn)，我們的科學(xué)家通過改造pET載體，獲得雙表達(dá)質(zhì)粒（BiPlasmid vector），該質(zhì)粒含有雙MCS位點(diǎn)，雙T7啟動子，雙lac操縱子和雙核糖體結(jié)合位點(diǎn)，利用該質(zhì)粒我們可以為客戶進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染操作，而獲得兩種蛋白的獨(dú)立表達(dá)。

啟動子：重組蛋白大腸桿菌表達(dá)體系中，lac啟動子是最為常用的啟動子之一。當(dāng)培養(yǎng)基中只存在乳糖（lactose）作為唯一碳源時(shí)，lac啟動子被激活，開始重組蛋白表達(dá)。我們常用帶T7啟動系統(tǒng)的pET系列載體為客戶表達(dá)目的蛋白，當(dāng)含有T7啟動系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)菌后，挑取單克隆，培養(yǎng)并加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一種非水解性的乳糖類似物）誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白。為了消除重組蛋白本底表達(dá)，我們在原先的pET系列質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上加入了T7溶酶體與T7 RNAP（RNA polymerase）共表達(dá)，T7溶酶體能夠結(jié)合T7 RNA聚合酶并限制T7啟動子介導(dǎo)的起始轉(zhuǎn)錄。

抗性篩選標(biāo)簽：質(zhì)粒載體通常采用的抗性基因包括氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素，慶大霉素和四環(huán)素等抗性基因，在重組蛋白表達(dá)與純化過程中，大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨芐青霉素37℃條件下半衰期為16小時(shí))或被去除掉，只剩下微量殘留（一般<1pg/ml純化蛋白），我們開發(fā)了相應(yīng)的ELISA試劑盒能夠快速檢測抗生素殘留量（檢測靈敏度0.1pg/ml）。

親和標(biāo)簽：重組蛋白表達(dá)過程中采用親和標(biāo)簽一方面是為了使蛋白純化過程更加容易；另一方面是為了促進(jìn)某些不溶性蛋白可溶。蛋白標(biāo)簽可分兩類：一類是短肽類標(biāo)簽；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達(dá)。長肽類標(biāo)簽更多的作用是促進(jìn)蛋白可溶性，往往需要同時(shí)加入短肽標(biāo)簽以幫助蛋白純化；短肽類標(biāo)簽一般只含幾個(gè)氨基酸，分子量均<2 kDa，對重組蛋白的性質(zhì)影響較小。親和標(biāo)簽可以放置在蛋白的C-端和N-端，如需要表達(dá)分泌性蛋白，則放置于C-端，信號肽放置于N-端。

標(biāo)簽移除：一般性的生物學(xué)研究過程中，蛋白標(biāo)簽可以不用移除，如GST pull down實(shí)驗(yàn)和CO-IP實(shí)驗(yàn)則需要保留GST和His標(biāo)簽以便將目的蛋白從混合物中直接分離出來。當(dāng)涉及到蛋白結(jié)構(gòu)研究時(shí)，則蛋白標(biāo)簽或融合伴侶需要被移除掉。去除蛋白標(biāo)簽的方法分為兩類，一類是酶消化法；一類是化學(xué)裂解法?；瘜W(xué)裂解法通產(chǎn)被用于融合伴侶蛋白的移除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽，該方法優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，缺點(diǎn)是蛋白序列中不能存在Met氨基酸殘基。酶消化法是目前最為常用的蛋白標(biāo)簽去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標(biāo)簽，只殘留少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基。帶有His標(biāo)簽的TEV蛋白酶逐漸被廣泛接受用于蛋白標(biāo)簽移除實(shí)驗(yàn)，該蛋白酶具有一個(gè)非常優(yōu)秀的特點(diǎn):切除標(biāo)簽后，只殘留一個(gè)Ser或Gly殘基或完全不殘留氨基酸殘基。這也是目前卡梅德生物科技常用的一種蛋白標(biāo)簽去除方法。

問題三：選擇合適的蛋白表達(dá)宿主

重組蛋白原核表達(dá)常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達(dá)宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株，隨后不同基因工程修飾菌株隨之誕生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質(zhì)蛋白。同時(shí)BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變，菌株失去甲基化和降解外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的能力，使得質(zhì)粒能夠傳代保留至子代細(xì)菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）。

K-12系列菌株具有兩大優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)是能夠促進(jìn)胞質(zhì)中蛋白二硫鍵的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變；另外一個(gè)是recA基因突變，改基因突變后外源質(zhì)粒在宿主菌種中得以穩(wěn)定存在。

問題四：成功表達(dá)一個(gè)重組蛋白，需要的策略組合

重組蛋白的表達(dá)往往不像理論那樣一帆風(fēng)順，在實(shí)際的表達(dá)過程中有可能產(chǎn)生各種各樣的問題。在選擇一個(gè)最優(yōu)的蛋白表達(dá)策略非常困難的情況下，那么采用看似笨拙的方法，有可能會成為一種意想不到的“成功捷徑”，比如項(xiàng)目要求構(gòu)建表達(dá)兩種重組蛋白時(shí)，構(gòu)建6種不同的表達(dá)質(zhì)粒，意味著有36種不同的表達(dá)條件組合，通過高通量微量蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)一次性就可獲得最佳蛋白表達(dá)條件組合，后續(xù)中式飛行試驗(yàn)和成本控制會變得相對容易。

服務(wù)優(yōu)勢：

*密碼子優(yōu)化：包含稀有密碼子分析，蛋白親水性分析和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析

*多種融合標(biāo)簽載體和宿主，以保證高可溶蛋白表達(dá)和高蛋白活性

*多種規(guī)模蛋白發(fā)酵模式：小規(guī)模（500ml，2.5L，10L和30L）、大規(guī)模（80L，130L，250L和500L發(fā)酵罐）

*短時(shí)間內(nèi)制備高純度毫克級，克級重組蛋白

*低內(nèi)毒素：LAL檢測法<0.1EU/mg

*完整的GMP文件支撐體系，服務(wù)中所有材料、試劑和制備信息可追溯