發(fā)布日期：2019-08-27
諾貝爾獎(jiǎng)得主、美國(guó)生物化學(xué)家凱利·穆利斯不久前去世，他發(fā)明的PCR擴(kuò)增技術(shù)，將生物學(xué)劃分為兩個(gè)時(shí)代：PCR前時(shí)代和PCR后時(shí)代——
一人聲微，萬人聲振聾發(fā)聵。
諾貝爾獎(jiǎng)得主、美國(guó)生物化學(xué)家凱利·穆利斯所發(fā)明的PCR技術(shù)，正是通過“百萬倍復(fù)制”的方法讓DNA攜帶的生命密碼發(fā)出振聾發(fā)聵的聲音，幫助人們將其一一捕捉。
不久前，穆利斯的去世讓人們回想起追逐DNA密碼的艱難歲月，而PCR技術(shù)的發(fā)明給了人們解密“利器”，這也是為什么《紐約時(shí)報(bào)》評(píng)價(jià)這一技術(shù)的誕生將生物學(xué)劃分為兩個(gè)時(shí)代：PCR前時(shí)代和PCR后時(shí)代。
開車途中靈光閃現(xiàn) 1983年實(shí)現(xiàn)第一個(gè)PCR片段
“當(dāng)我走到我的銀色思域車前時(shí)，我感覺很虛弱。弗雷德（穆利斯的助理）、空試驗(yàn)瓶以及PCR時(shí)代的曙光都不能取代珍妮（穆利斯女友）。我感覺孤獨(dú)。”據(jù)記載，穆利斯在諾貝爾獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)現(xiàn)場(chǎng)的演講中這樣說道。
穆利斯創(chuàng)新性的靈光一閃出現(xiàn)在深夜載女友開車的途中，這位有著藝術(shù)家氣質(zhì)的科學(xué)家想必也是在愛人的身上找到靈感的源泉。他意識(shí)到在將DNA雙鏈高溫解旋為單鏈后，可以用引物將需要的目標(biāo)片段指數(shù)倍地?cái)U(kuò)增，在體外模仿體內(nèi)的互補(bǔ)擴(kuò)增過程。N次循環(huán)后，便可得到2n倍的DNA片段，用來進(jìn)一步分析。
初期的PCR反應(yīng)體系極端簡(jiǎn)陋、低效，且有諸多需要完善的地方。西安交通大學(xué)教授、天隆科技創(chuàng)始人彭年才講道，后來其他科學(xué)家在黃石公園的溫泉里，分離得到嗜熱菌株，發(fā)現(xiàn)了耐熱的DNA聚合酶，才大大提升了PCR的實(shí)驗(yàn)效率，更進(jìn)一步促進(jìn)了PCR技術(shù)的應(yīng)用和商業(yè)價(jià)值。
秒表、水浴鍋、提籃……構(gòu)成了最初期的PCR操作系統(tǒng)，和現(xiàn)代高端的PCR儀有著天壤之別。“那時(shí)候根本談不上自動(dòng)，人工手動(dòng)需要長(zhǎng)時(shí)間地操作。”彭年才說，最初期的PCR反應(yīng)并沒有儀器，用一個(gè)裝有PCR標(biāo)本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，由于一整套反應(yīng)所需要的反應(yīng)體系以及溫度并不相同，例如高溫解鏈時(shí)需要95℃、引物“粘”上DNA鏈時(shí)則是58℃、而新鏈延長(zhǎng)則需要72℃，因此每一階段都需要換一個(gè)水浴鍋，以維持化學(xué)反應(yīng)得以進(jìn)行。
標(biāo)本在每個(gè)水浴箱中恒溫的時(shí)間用秒表計(jì)時(shí)，然后移動(dòng)，加上標(biāo)本開蓋暴露點(diǎn)樣做電泳，因此難以控制液體污染、移動(dòng)。
無論如何簡(jiǎn)陋和不精準(zhǔn)，1983年12月，穆利斯用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后49bp長(zhǎng)度的第一個(gè)PCR片段，這一“從0到1”的突破成就了后來的PCR時(shí)代。
發(fā)展經(jīng)歷3代 PCR儀檢測(cè)DNA分子超靈敏
今年3月，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“熒光數(shù)字基因擴(kuò)增單分子檢測(cè)儀”項(xiàng)目召開啟動(dòng)會(huì)。為解決我國(guó)高端科學(xué)儀器仍受國(guó)外制約的現(xiàn)狀，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃設(shè)立了重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)重點(diǎn)專項(xiàng)，從頂層設(shè)計(jì)層面將我國(guó)的儀器做好，達(dá)到新水平，實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
“根據(jù)穆利斯的發(fā)現(xiàn)形成的第一代PCR儀只能回答‘有無’的問題，即有沒有某段DNA，但人們還想回答有多少的問題。”彭年才是國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，他介紹，PCR儀的發(fā)展目前經(jīng)歷了3代。
第1代PCR儀器由于有了變溫器，消滅了水浴鍋和人工轉(zhuǎn)移等步驟，大大提高了效率，只需一次加入酶、引物、模板、緩沖溶液等就可以進(jìn)行PCR反應(yīng)；第2代PCR如實(shí)時(shí)熒光定量PCR，不僅回答有無，還想回答有多少即定量的問題，因此引入了熒光基團(tuán)和感光元件，根據(jù)光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)分析；第3代的數(shù)字PCR，則將反應(yīng)體系再進(jìn)行微小分割，理論上要讓每個(gè)微反應(yīng)單元中只有單個(gè)DNA分子為模板就能實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)超高靈敏度的核酸絕對(duì)定量檢測(cè)，精確地探索生命體中DNA分子的情況。
PCR于1983年前后被發(fā)明，在穆利斯1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)之前，彭年才1991年前后就開始涉足研制中國(guó)自己的PCR儀，后續(xù)帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)一直專注到今天。國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃數(shù)字PCR項(xiàng)目啟動(dòng)會(huì)上，院士專家也曾評(píng)價(jià)道：在目前主流的2代PCR核酸檢測(cè)產(chǎn)品方面，彭年才團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的產(chǎn)品以多樣化解決方案和高品質(zhì)高可靠的數(shù)據(jù)，成為疾病診斷和檢測(cè)控制的保障設(shè)備，同時(shí)也廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域食源性致病菌檢測(cè)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。“中國(guó)自己的分子診斷儀器一度不被市場(chǎng)接受，有很多方面的原因，但改變?nèi)藗儗?duì)于國(guó)產(chǎn)儀器不耐用、不準(zhǔn)確的印象或者偏見，必須靠自主研發(fā)和技藝的精進(jìn)。”彭年才說。
“2014年西非埃博拉疫情期間，在國(guó)家科技部、國(guó)家藥監(jiān)總局和中國(guó)援外醫(yī)療隊(duì)等的幫助下，我們?cè)谌阂邊^(qū)完成了348例疑似病例的臨床研究，檢出陽(yáng)性標(biāo)本166例。”彭年才說，中國(guó)的分子診斷儀器越來越多地在國(guó)際戰(zhàn)場(chǎng)上嶄露頭角。
在3代PCR儀的角逐中，數(shù)字PCR還有諸多高技術(shù)和難點(diǎn)需要攻克，中國(guó)創(chuàng)新也在迎頭趕上?？萍疾繃?guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，對(duì)項(xiàng)目承擔(dān)單位提出了要求，既要突破有針對(duì)性的核心技術(shù)，形成關(guān)鍵部件及樣機(jī)，也要具有先進(jìn)性，并達(dá)到一定市場(chǎng)占有率，接受市場(chǎng)的檢驗(yàn)。
想吃正宗烤串 PCR能夠測(cè)出是羊肉還是鴨肉
“目前，暫沒有成熟的新技術(shù)能夠取代PCR技術(shù)，它從原理上模擬了體內(nèi)的生命過程，源于真實(shí)高于真實(shí)。”彭年才說，但現(xiàn)代的PCR解決方案，包括反應(yīng)體系建立和核酸提取PCR試劑系統(tǒng)，以及包括光機(jī)電、自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)、熱學(xué)等多個(gè)學(xué)科集合體的PCR儀器系統(tǒng)，在精度、廣度和速度上實(shí)現(xiàn)了不斷的超越。
三個(gè)維度的極限超越，將使得PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷拓寬。“比如，夏天晚上你想吃點(diǎn)燒烤，卻又疑慮這個(gè)羊肉串其實(shí)是鴨肉，這個(gè)鑒別的工作PCR技術(shù)當(dāng)然能夠勝任，PCR能夠檢測(cè)出羊肉相關(guān)的特異性基因片段，但我急等吃羊肉串，等不及啊，你能否在速度上有所突破？使PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)間從小時(shí)縮短到數(shù)分鐘，這就能更廣泛地開辟應(yīng)用新領(lǐng)域，相應(yīng)也給科學(xué)家提出了新難題，從而也派生出快速PCR的新興研究領(lǐng)域。”彭年才表示。
精度方面，在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用“眼里容不下半點(diǎn)沙子”，因此PCR應(yīng)用初期的假陽(yáng)性必須消除。隨著技術(shù)的進(jìn)步，通過反應(yīng)體系的優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、PCR實(shí)驗(yàn)前后質(zhì)控，以及儀器在精準(zhǔn)高效的閉管操作、溫控系統(tǒng)、科學(xué)合理的光學(xué)系統(tǒng)、軟件系統(tǒng)等多方面的改進(jìn)和突破，PCR儀器以及相關(guān)試劑盒均能夠達(dá)到相關(guān)部門的醫(yī)療機(jī)構(gòu)準(zhǔn)入門檻。
據(jù)介紹，以PCR檢測(cè)手段為代表的分子診斷目前已在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、疫情防控、食品安全、檢驗(yàn)檢疫及法醫(yī)鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用，國(guó)家“十三五”規(guī)劃等也出臺(tái)政策，近年來中國(guó)市場(chǎng)每年以20%速率增長(zhǎng)。近兩年國(guó)家器審中心審批的分子診斷產(chǎn)品也越來越多。
除了對(duì)病原體、腫瘤等的檢測(cè)，PCR應(yīng)用還在探索新的領(lǐng)域。彭年才介紹，在高血壓“看人給藥”的精準(zhǔn)診斷方面，PCR技術(shù)有了新的應(yīng)用突破。“我們自主研發(fā)的高血壓個(gè)體化用藥熒光PCR熔解曲線法基因檢測(cè)試劑,已經(jīng)通過國(guó)家藥監(jiān)總局注冊(cè)審批的，可以用標(biāo)記探針檢測(cè)高血壓用藥相關(guān)的七項(xiàng)基因突變指導(dǎo)五大類高血壓用藥。”彭年才解釋，一種高血壓藥對(duì)不同的人療效可能不同，PCR檢測(cè)成本低、給報(bào)告快，可以找到患者最適宜的用藥。
“現(xiàn)在PCR檢測(cè)最快可1小時(shí)給出報(bào)告，但在很多領(lǐng)域還需多管齊下，更快給出診斷。”彭年才說，對(duì)于分子診斷高端設(shè)備來說，精度、廣度、速度的極限突破將是自主創(chuàng)新者永恒的追求。
來源：科技日?qǐng)?bào)
