發(fā)布日期：2019-07-16
數(shù)字PCR簡介
數(shù)字PCR（Digtal PCR）是一種核酸定量精密檢測的新興技術(shù)手段，于20世紀由Vogelstein等提出。它是將稀釋后的核酸模板分配到大量不同的反應(yīng)單元中，使每個反應(yīng)單元中有一個或沒有核酸。利用PCR擴增的同時，加入可檢測熒光。待擴增結(jié)束時，使用統(tǒng)計學(xué)方法采集每個反應(yīng)單元出現(xiàn)的熒光次數(shù)，從而定量檢測樣本中的核酸濃度。
基于分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為3種：微流體數(shù)字PCR(Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)和芯片數(shù)字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)。
數(shù)字PCR的優(yōu)勢
相對于二代測序、基因芯片和定量PCR而言，數(shù)字PCR具備以下優(yōu)勢:
· 靈敏度可達到單個核酸分子：檢測限低至0.001%，主要系為數(shù)字PCR可以實現(xiàn)靶標DNA/RNA的生物濃縮；
· 無需標準曲線活參照基因進行對比來測定核算量，可對靶分子起始量進行絕對定量，直接獨處DNA分子的個數(shù)；
· 適合環(huán)境復(fù)雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響，避免樣品間的交叉感染問題，適合各類復(fù)雜環(huán)境中的樣本進行絕對定量，如動血樣、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等；
· 能夠有效區(qū)分濃度差異微小的樣品：更好的準確度、精密度和重復(fù)性，可以用于精確測定靶基因的相對表達，基因拷貝數(shù)變異分析等。
· 數(shù)字PCR可開發(fā)針對不同癌癥、不同樣本以及不同的樣本環(huán)境提供檢測解決方案，該技術(shù)的應(yīng)用范圍廣泛，尤其在液體活檢領(lǐng)域，已開發(fā)針對肺癌、乳腺癌、腸癌、胃癌等上百個位點檢測試劑盒，可精準指導(dǎo)臨床治療的診斷，以便患者在后續(xù)得到更及時并且適當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁?/p>
數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用
隨著美國FDA批準了一款用于白血病BCR-ABL融合基因檢測的數(shù)字PCR試劑盒，標志了這一技術(shù)正式走向廣闊的臨床應(yīng)用市場。我國的分子診斷市場正處于快速發(fā)展階段，預(yù)計2021年可以達到100億以上的規(guī)模，而數(shù)字PCR將成為這一市場高速增長的重要驅(qū)動力。
數(shù)字PCR技術(shù)可廣泛應(yīng)用于腫瘤液體活檢、靶向治療伴隨診斷、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測、病原微生物（病毒、細菌、真菌等）檢測、食品安全檢測、遺傳疾病診斷、移植排斥監(jiān)控、腸道菌群分析、藥物基因組檢測、基因表達分析、環(huán)境檢測和分子生態(tài)、農(nóng)業(yè)和動植物檢測等多個研究方向。以下簡要介紹其中幾種。
1. 腫瘤的早期研究
循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是活腫瘤細胞釋放的DNA，半衰期約為1.5h。對循環(huán)腫瘤DNA進行及時監(jiān)測分析，不僅有利于早期發(fā)現(xiàn)癌癥，還能監(jiān)測癌癥復(fù)發(fā)情況，這對癌癥患者的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。與腫瘤組織活檢相比，血液循環(huán)腫瘤DNA分析具有微創(chuàng)性，可以定期隨訪癌癥患者監(jiān)測癌癥。然而，使用ctDNA進行早期癌癥診斷也并不容易，因為血液中存在的腫瘤DNA的量較少，并且腫瘤DNA會被源自非腫瘤細胞的DNA稀釋?；谝旱蔚臄?shù)字PCR等新技術(shù)的開發(fā)大大提高了檢測稀有序列的靈敏度、特異性和精確度，為癌癥的早期研究和診斷奠定基礎(chǔ)。
2. 腫瘤治療的伴隨診斷
常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，實現(xiàn)腫瘤標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴增檢測等，應(yīng)用于腫瘤精準醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。
3.無創(chuàng)產(chǎn)前篩查
現(xiàn)有的遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷方法大都需要通過羊膜穿刺、絨毛取樣等侵入性技術(shù)從母體子宮內(nèi)得到胎兒樣本(細胞、排泄物等) 再進行遺傳學(xué)分析。經(jīng)過幾十年的發(fā)展與完善，無論是準確度和安全性都已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)界的公認，但仍存在一定程度的胎兒流產(chǎn)和死胎的可能性。
基于母體血液分析的無創(chuàng)產(chǎn)前遺傳疾病篩查是如今的研究熱潮。如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測或已知父母基因型的其它核酸病檢測（孟德爾相關(guān)遺傳疾病）。由于目前標本來源主要為血液，而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，因此檢測的準確性受到影響。基于獨特的微滴化數(shù)字PCR技術(shù)，可作為二代測序法的補充進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，從而提高準確度及分辨率。因此，數(shù)字PCR技術(shù)在遺傳學(xué)產(chǎn)前檢查中具有廣泛的應(yīng)用前景。
4.病原微生物的檢測
疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統(tǒng)的實驗室，采用數(shù)字PCR技術(shù)了可滿足該類實驗室對于檢測結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無需依賴標準曲線的絕對定量結(jié)果，同時操作簡便。
對于研究類型的實驗室，可利用dPCR靈敏度高的特點，對各種樣品中的病原微生物進行研究。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內(nèi)感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等。
5. 甲基化含量鑒定
作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來進行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統(tǒng)計法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等。這些方法皆因方法學(xué)的問題而不能獲得精確的定量，而微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微滴化處理及目標因子的絕對拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種全新的技術(shù)。
6.拷貝數(shù)分析
基因拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNVs）是指人類基因組中存在的，較之于參照基因組DNA片段缺失或復(fù)制大于1kb到Mb的亞微觀結(jié)構(gòu)變異，CNVs本身蘊含著豐富的遺傳信息，對于研究基因變異在生物進化及疾病進程等領(lǐng)域具有重要意義。相較于現(xiàn)有的CNVs研究技術(shù)（定量PCR、高密度寡核苷酸芯片high density oligo nucleotide array，F(xiàn)ISH，比較基因組芯片microarray based comparative genomic hybridization，array-CGH，測序等），dPCR在靈敏度和分辨率方面更具優(yōu)勢，尤其適用于更高拷貝數(shù)分析，確定確切的拷貝數(shù)，檢測精度超過±10%。
數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)跑者
國際上，ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad是數(shù)字PCR儀器領(lǐng)域的兩大巨頭。
· ABI（Applied Biosystems）：ABI的dPCR儀器為QuantStudio 3D，采用芯片式分液技術(shù)，操作流程全自動；
· Bio-Rad：Bio-Rad的dPCR儀器包括QX200和RainDrop，均采用液體式分液技術(shù)，操作流程均半自動。在價格上，RainDrop優(yōu)于QX200和QuantStudio3D。
另外，基因行業(yè)巨頭例如Illumina、Roche（羅氏）、ThermoFisher（賽默飛）、Qiagen（凱杰）等均已布局數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域，極大地推動了該領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化進程。
國內(nèi)企業(yè)包括泛生子、永諾生物、科維思、諾禾致源、小海龜科技、領(lǐng)航基因、新羿生物、愛普拜、銳訊生物均已進軍數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域。（對于布局數(shù)字PCR技術(shù)的公司，如有遺漏，歡迎大家在評論區(qū)進行補充哦。）
總而言之，數(shù)字PCR技術(shù)自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因檢測等分子診斷領(lǐng)域等領(lǐng)域發(fā)揮了不可替代的作用?？梢灶A(yù)見，它將繼續(xù)引領(lǐng)分子診斷熱潮，推動精準醫(yī)療的發(fā)展。
來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
