發(fā)布日期：2019-07-09
解碼基因編輯
演藝界宋仲基宋慧喬的分手讓人直呼：只愿曾經(jīng)未相遇。而生物界的相遇卻往往讓人感慨：相見恨晚——張鋒，一位“八零后”科學家，因發(fā)明最有效的基因編輯方法成名，被稱為CRISPR之父。
芭芭拉·麥克林托克，很多人并不熟悉，但她所在的冷泉港實驗室被認為是思想最活躍的科研圣地。芭芭拉是上個世紀的“零零后”（1902年出生），在她的年代，人們認為基因是“牢固錨定”的，但她卻要證明基因是能夠“跳動”的，她的系統(tǒng)性研究和對科學的堅持，最終打破了人們保守的觀念，并因此獲得1983年的諾貝爾獎。
兩位科學家跨越百年的研究成果終于“相遇”?！犊茖W》和《自然》近日接連發(fā)文介紹了兩種新型CRISPR技術，均是通過利用“跳躍基因”的性質(zhì)改進CRISPR技術的靶向準確性。
都能編輯基因，“單身”時它們這樣工作
CRISPR/Cas9技術是CRISPR技術的全稱，前面的“CRISPR”是“制導靶標”，后面的Cas9才是真正的“剪刀”。
在基因的世界里，“制導”一定是依賴堿基序列的，對于CRISPR來說，它只認定一種序列那就是成簇、規(guī)律間隔、短回文、重復序列。通過向?qū)NA識別符合要求的序列，引來Cas9蛋白對序列進行切割。
切割過程有著小視頻的動態(tài)特點。Cas9蛋白先與向?qū)NA形成復合體，Cas9蛋白會發(fā)生構象上的變化，就像一張白紙卷成一個“筒狀”，更容易讓DNA進出。這個柔軟的復合體會在DNA里四處碰撞，如果識別錯誤，“紅燈亮”，復合體就離開，繼續(xù)下一次碰撞；如果識別正確，“綠燈亮”，開始剪切編輯的嘗試。
Cas9蛋白開始“動剪刀”前，還需要再校驗，它把雙鏈DNA解旋，利用RNA-DNA堿基互補配對原則，進一步核對序列與RNA的互補情況。如果出現(xiàn)較多錯配，則序列識別過程終止，從而確保Cas9在正確的目標處發(fā)揮作用。如果完成識別，那么Cas9進一步被激活，開動剪刀。
跳躍基因則完全不同，它不受約束，“痛恨”一切教條，與CRISPR“重復”“短回文”等教條的屬性似乎完全不在一個“頻道”。它可以從自己的位置上“自由出走”，單獨復制或斷裂下來，并為自己“編制”一個環(huán)狀船，四處“游走”，遇到合適的地方，再插入另一位點。
芭芭拉發(fā)現(xiàn)它是因為它所引發(fā)的玉米形狀的隨意變化。她在印度彩色玉米中觀察到，籽粒和葉片往往存在著許多色斑。色斑的大小、出現(xiàn)的早晚不定，這些變化，受到某些不穩(wěn)定基因或“異變基因”之間相互調(diào)控的控制。
跳躍基因堪稱“自由主義者”的典范，人們至今難以把握什么能激活它的跳躍。但大名鼎鼎的LINE1是一種主要的跳躍基因，《細胞》子刊刊載科學家“抓住了它的尾巴”，只有在POLY-A（多聚A）“尾巴”存在的情況下，LINE1才會啟動跳躍，沒有“尾巴”跳躍基因就會失活。此外，轉(zhuǎn)座酶是啟動轉(zhuǎn)座的關鍵性因子，目前，人們已經(jīng)掌握了通過轉(zhuǎn)座酶引導和控制跳躍基因的一些方法。
一對天然“CP”，雙方何以“互補”
CRISPR/Cas9基因編輯技術，現(xiàn)階段面臨著精確修復比例低、識別序列受限、脫靶現(xiàn)象等問題。根據(jù)基因“魔剪”的工作機理，可以看出單獨的“制導定位”、解鏈剪切、互補修復理論上都是行得通的。
問題出在外來的干預和影響，勢必會遭受系統(tǒng)本身的校正。“只要向?qū)NA設計得當、定位準確，精準刪除相應的DNA片段并不難。”相關專家表示，但在替換過程中，會激活體內(nèi)的DNA修復系統(tǒng)，這套修復系統(tǒng)有著較高的容錯能力，有可能變成可以耐受DNA損傷的問題基因。
而CRISPR攜帶的目標基因需要靠同源重組才能結合到靶基因組中，同源重組容錯率低，遵循配對原則，因此面臨著修復系統(tǒng)“競爭”，導致整合效率低下，甚至完全被壓制，造成難以想象的脫靶效應。
向?qū)τ贑RISPR依賴的同源重組進行序列插入，轉(zhuǎn)座子的“移花接木”功能更加強勢。細菌中的Tn轉(zhuǎn)座子，是一段含有若干抗性基因和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段。兩末端重復或倒置，對應轉(zhuǎn)座酶的作用位點。當結合到靶DNA上時，轉(zhuǎn)座復合體識別并攻擊靶序列將轉(zhuǎn)座子插入到靶序列中。整個轉(zhuǎn)座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA的過程，實現(xiàn)了基因的“跳躍”。
新的研究工作，正是將關鍵的Cas9“剪刀”進行了改變，取而代之一種新的復合酶。據(jù)介紹，研究人員建立了一種CRISPR相關轉(zhuǎn)座酶，一半是CRISPR效應蛋白Cas12k，與Cas9一脈相承，但對DNA只結合不剪切，只負責定位靶基因組，剪切替換的工作由轉(zhuǎn)座酶“接手”，可以將基因片段直接插入靶位點，完全免除了對靶基因組的切割步驟。
可見，跨越百年的相遇，體現(xiàn)在對于關鍵酶的改良中，通過對不同來源的酶的整合、改造，使得新的Cas系統(tǒng)產(chǎn)生。據(jù)測試結果顯示，該系統(tǒng)能在大腸桿菌（原核生物）基因組中實現(xiàn)高達80%的插入成功率，而遠遠高于CRISPR/Cas9系統(tǒng)相應編輯的成功率。
事實上，這并不是首次嘗試將兩種編輯基因的方法聯(lián)合起來。據(jù)報道，《BMC生物學》雜志2014年發(fā)表了一項研究，科學家們在細菌和古生菌中發(fā)現(xiàn)了一類新型的轉(zhuǎn)座子，這種轉(zhuǎn)座子不僅含有Cas內(nèi)切酶的編碼基因，還依賴這種酶整合到新的基因組區(qū)域，科學家將這種新型的轉(zhuǎn)座子元件稱為“Casposon”?？梢?，這對“CP”可能原本就存在于自然界中。
編輯不同物種，改良一直在路上
基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)是源自于原核生物抵御外來遺傳元件的侵襲進而開發(fā)出來的。Tn7轉(zhuǎn)座子也來源于原核生物大腸桿菌。前者把握了方向，后者進行了實際操作。
在真核基因中，它們表現(xiàn)如何，仍需要進一步地反復嘗試、修改和驗證。
“馬賽克現(xiàn)象”是該基因編輯工具應用于真核生物生殖細胞編輯時一直難以解決的問題。“我們用顯微注射的方法對受精卵進行CRISPR基因編輯，希望獲得相應的基因編輯動物。”武漢大學中南醫(yī)院研究助理教授姬燕曉表示，但這些方式獲得的動物個體可能同時帶有編輯細胞與未編輯細胞的嵌合個體。也就是說有的基因編輯小鼠可能只有腿部細胞編輯成功，或者其他局部，這對于構建動物模型來說是非常影響效率的。
“我們只能從轉(zhuǎn)基因動物下一代中篩選確定能夠穩(wěn)定遺傳的個體，這對于大動物來說，非常耗時耗力。”姬燕曉說。
廣東醫(yī)科大學袁偉曦等在《CRISPR/Cas9技術存在的問題及其改進措施的研究進展》中分析，“馬賽克現(xiàn)象”的發(fā)生，可能是由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用于多細胞生物的受精卵基因編輯時，受精卵分裂成不同的卵裂球，而Cas9蛋白對不同卵裂球的編輯能力和修復方式不同，從而出現(xiàn)帶有不同編輯類型的細胞的嵌合個體；也可能是受精成功到基因組第一次復制的時間極為有限，給基因編輯留下的“時間窗”很短。
為此，對于基因編輯技術提高精準性、降低錯配率等的研究工作仍需要持續(xù)推進，以針對不同的物種，獲得最優(yōu)的組合和解決方案。
來源：科技日報
