發(fā)布日期：2019-06-27
導(dǎo)語：
3D打印又稱增材制造，正在推動如工程、制造、藝術(shù)、教育和醫(yī)學(xué)等行業(yè)的重大創(chuàng)新。3D打印技術(shù)可將生物相容的材料、細(xì)胞和相關(guān)部件組成復(fù)雜的活組織，可被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，以滿足對適合移植的組織和器官的需求。
與非生物打印相比，3D生物打印更為復(fù)雜：要克服包括材料的選擇、細(xì)胞類型、生長和分化因子以及與活細(xì)胞敏感性和組織結(jié)構(gòu)相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)。解決這些復(fù)雜問題需要綜合來自工程、生物材料科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、物理學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)。3D生物打印技術(shù)先已被用于多種組織的生成和移植，包括多層皮膚、骨骼、血管移植、氣管夾板、心臟組織和軟骨結(jié)構(gòu)。其他應(yīng)用包括開發(fā)用于研究、藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)的高通量3D生物打印組織模型。
一、3D生物打印的方法策略
1. 仿生學(xué)
即對組織或器官的細(xì)胞和細(xì)胞外成分進(jìn)行體外復(fù)制，復(fù)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的同時也要保證功能的實現(xiàn)。實現(xiàn)這一過程的關(guān)鍵是成功復(fù)制特定組織內(nèi)細(xì)胞的功能成分。因此，在進(jìn)行體外模擬之前，應(yīng)該研究清楚微環(huán)境中具有功能性和支撐性的不同類型細(xì)胞排列、溶質(zhì)和不可溶分子的濃度區(qū)間、細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成和生理狀態(tài)下的受力情況等各方面因素，而這些又涉及到工程學(xué)、圖像學(xué)、生物材料、細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域的交叉研究。
2. 自組裝
即利用胚胎作為生物組織復(fù)制的原材料。由于發(fā)育中的組織的早期細(xì)胞可自發(fā)地產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、適當(dāng)?shù)募?xì)胞信號、自主組織以及模式，可以定向形成所需的生物微結(jié)構(gòu)和功能。這種方法不需要支架，僅使用經(jīng)過融合和細(xì)胞組織的自組裝的細(xì)胞球體來模擬正在發(fā)育的組織。此方法需要對胚胎組織和器官的發(fā)生發(fā)育機(jī)制有深入的了解，并能通過操縱環(huán)境來驅(qū)動3D生物打印組織中的胚胎生長。
3. 微型組織、器官
微型組織的概念和前面提到的兩種3D生物打印方法及其相關(guān)。首先，器官和組織是由更小的柔性功能單元或者微型組織構(gòu)成的。比如腎原可以被定義為腎臟組織內(nèi)最小的功能單元。這些微型組織可以通過合理的設(shè)計和自主裝配組成更大的功能組織結(jié)構(gòu)。這其中主要涉及到兩種方法，一種是結(jié)合生物學(xué)設(shè)計和結(jié)構(gòu)將自我組裝的細(xì)胞集團(tuán)，再次組裝成功能性的宏觀組織；另外一種是設(shè)計并復(fù)制出準(zhǔn)確、高分辨率的組織單元，然后再自行組裝成具有生理功能的宏觀組織。比如，各個血管構(gòu)建模塊單元自我組裝后形成支血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。利用3D生物打印可實現(xiàn)功能組織單元的精準(zhǔn)復(fù)制，再通過微流控系統(tǒng)提供維持功能的養(yǎng)分和信息交換通道的器官芯片，可最終用于體外疫苗、藥物的篩選和疾病模型建立。
要打印出具有多種功能、結(jié)構(gòu)及性能的復(fù)雜三維生物結(jié)構(gòu)，可能需要結(jié)合上述策略的一種或幾種。另外，生物打印過程中的主要步驟是模型設(shè)計、材料和細(xì)胞的選擇以及組織結(jié)構(gòu)的打印等。最終打印出來的結(jié)構(gòu)可在體外培養(yǎng)一段時間后移植到體內(nèi)，或者直接在體外進(jìn)行下一步分析處理。
二、3D打印過程
1. 醫(yī)學(xué)成像技術(shù)與模型設(shè)計
復(fù)制結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜、不均一的組織或者器官需要對其各組成成分的空間結(jié)構(gòu)和排列具有完整全面的認(rèn)識和理解。醫(yī)學(xué)成像技術(shù)可以提供研究對象中細(xì)胞、組織、器官和機(jī)體水平上的3D結(jié)構(gòu)功能信息。這些技術(shù)包括計算機(jī)斷層掃描（CT）以及核磁共振技術(shù)（MRI）等。計算機(jī)輔助設(shè)計和計算機(jī)輔助制造(CAD-CAM)工具和數(shù)學(xué)建模則用于復(fù)雜組織的成像和結(jié)構(gòu)組成信息的收集和數(shù)字化。
CT成像基于不同組織對x射線的不同程度地吸收來進(jìn)行觀察和診斷。其原理是X射線源繞著物體旋轉(zhuǎn)，隨著X射線穿透人體，傳感器測量傳輸?shù)墓馐鴱?qiáng)度和角度，并將數(shù)據(jù)記錄匯編、表示為組織小體積的像素整合。這種成像方式產(chǎn)生緊密間隔的組織結(jié)構(gòu)軸向切片，經(jīng)過表面渲染和立體光刻編輯，可以充分描述組織的結(jié)構(gòu)。
MRI則可以在軟組織中提供較高的空間分辨率，具有對比度強(qiáng)、分辨率高的優(yōu)點，這對于軟組織成像非常有用。原理是利用核磁共振，強(qiáng)磁場使成像組織中的一小部分細(xì)胞核與磁場對齊，原子核能量狀態(tài)的變化產(chǎn)生射頻信號，可以用接收線圈測量。
使用造影劑如鋇或碘進(jìn)行CT掃描，使用氧化鐵、釓或金屬蛋白進(jìn)行MRI掃描，可以大大提高生物結(jié)構(gòu)的對比度。這些制劑會衰減X射線或增強(qiáng)磁共振信號，而這些信號通常用于突出血管等結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)和周圍環(huán)境的對比。
2. 具體打印流程及原理
從這些成像方法中獲得原始成像數(shù)據(jù)后，須經(jīng)過重建處理才能生成二維橫斷面圖像。這個過程被描述為“分析解剖學(xué)”向“合成解剖學(xué)”的轉(zhuǎn)變。利用CAD-CAM和數(shù)學(xué)建模技術(shù)生成器官或組織結(jié)構(gòu)的三維模型和解剖視圖，同時保留可用于體積繪制、體積表示和三維圖像表示的圖像體積信息。
如果目標(biāo)是精確復(fù)制成像器官或組織，可以直接使用二維橫斷面或三維模型進(jìn)行生物打印。直接復(fù)制病人自己的器官不太現(xiàn)實(可能會有一定程度的疾病或損傷)，并且代價昂貴，來源有限，很難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。在這些情況下，基于計算機(jī)設(shè)計的模型將有助于對器官的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計、分析和仿真。此外，計算機(jī)建?？梢詭椭A(yù)測組織結(jié)構(gòu)的機(jī)械和生化特性。迄今為止，CT和MRI數(shù)據(jù)在再生醫(yī)學(xué)中最常被用于提供特定的組織尺寸測量數(shù)據(jù)，以幫助設(shè)計生物打印結(jié)構(gòu)。
將已完成的組織或器官模型與數(shù)控生物打印系統(tǒng)相連接，把3D描繪出的模型水平分割成數(shù)層2D水平薄片，再輸入進(jìn)3D生物打印系統(tǒng)中。二維水平切片中包含的解剖和構(gòu)型信息為生物打印設(shè)備提供了逐層沉積指令。生物打印技術(shù)的不同也會影響組織和器官的設(shè)計。比如一些生物打印系統(tǒng)會沉積連續(xù)的材料形成三維結(jié)構(gòu)。另外一些系統(tǒng)則會間斷不連續(xù)沉積多種材料。組織設(shè)計者必須考慮到生物打印系統(tǒng)的功能和特性。
三、生物打印主要方式
生物材料的沉積和制版技術(shù)主要有噴墨、微擠壓和激光輔助打印三種。3D生物打印中最重要的因素，即表面分辨率、細(xì)胞活力和打印用的生物材料決定這三種方法的特點。
1. 噴墨生物打印
噴墨打印機(jī)是非生物和生物應(yīng)用中最常用的打印機(jī)類型。第一個用于生物打印的噴墨打印機(jī)是商用的2D墨水打印機(jī)的改進(jìn)版本，墨盒里的墨水被一種生物材料代替，紙被一個升降臺控制。現(xiàn)在基于噴墨打印技術(shù)的生物材料是專門為處理和打印生物材料而設(shè)計的，其分辨率、精度和速度都在不斷提高。噴墨打印機(jī)將液體滴到基材上，基材可以支撐或成為最終結(jié)構(gòu)的一部分。這種范圍在200°C到300°C之間的局部加熱對生物分子的穩(wěn)定性沒有實質(zhì)性的影響，比如DNA分子或者或哺乳動物細(xì)胞的生存能力或打印后生理功能。
雖然噴墨打印機(jī)打印速度快、成本低、適用范圍廣。然而，細(xì)胞和材料暴露在熱應(yīng)和機(jī)械應(yīng)力下的風(fēng)險、液滴定向性低、液滴大小不均勻、噴嘴經(jīng)常堵塞和細(xì)胞封裝不可靠，這些都是噴墨打印機(jī)的缺點。
噴墨生物打印的另一個常見缺點是，生物材料必須是液態(tài)的，才能形成水滴。因此，打印出來的液體必須形成一個具有結(jié)構(gòu)組織和功能的立體結(jié)構(gòu)。使用噴墨生物打印技術(shù)的另一個限制是難以實現(xiàn)生物相關(guān)的細(xì)胞密度。通常，低細(xì)胞濃度(小于1000萬個細(xì)胞/毫升)用于促進(jìn)液滴的形成，避免噴嘴堵塞并降低剪切應(yīng)力。較高的細(xì)胞濃度也可能抑制一些水凝膠的交聯(lián)機(jī)制。
盡管有這些缺點，基于墨汁的生物燒結(jié)材料也具有成本低、分辨率高、速度快、與許多生物材料相容等優(yōu)點。另外，通過改變液滴密度或大小，可以在整個三維結(jié)構(gòu)中引入細(xì)胞、材料或生長因子的濃度梯度。由于打印出來呈液滴狀，所以更適合于單個細(xì)胞連續(xù)打印，從而進(jìn)行單細(xì)胞水平上的研究。
2. 微擠壓式生物打印
最常見的非生物3D打印機(jī)。其中有一些系統(tǒng)使用多個打印頭，以方便實現(xiàn)幾種材料的連續(xù)裝配。全球每年銷售近3萬臺3D打印機(jī)，學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)越來越多地購買和應(yīng)用微擠壓技術(shù)進(jìn)行組織和器官的工程研究。雖然價格昂貴，但在打印材料方面有更好的分辨率、速度、空間可控性和更大的靈活性。
微擠壓打印機(jī)的功能是通過裝配在基板上的一個微擠壓頭來控制的擠壓材料的輸出。微擠壓生產(chǎn)連續(xù)的材料而不是斷斷續(xù)續(xù)的液滴。在CAD-CAM軟件的指導(dǎo)下，將材料的小珠粒在二維空間內(nèi)沉積，使擠出頭沿z軸移動，沉積層作為下一層的基礎(chǔ)。用于3D生物打印的生物材料擠出最常用的方法是氣動或機(jī)械(活塞或螺釘)點膠系統(tǒng)。氣動打印機(jī)的優(yōu)點是具有更簡單的驅(qū)動機(jī)構(gòu)組件，其力僅受系統(tǒng)的氣壓能力的限制。機(jī)械驅(qū)動的機(jī)構(gòu)有更小和更復(fù)雜的組件，提供更大的空間控制，但會降低承受力的上限。
許多材料都與微擠壓打印機(jī)兼容，包括水凝膠、生物相容共聚物和細(xì)胞球體等材料。對于微擠壓式打印機(jī)，研究人員經(jīng)常開發(fā)可以熱交聯(lián)和/或具有薄層性能的材料。一些生物相容的材料可以在室溫下流動，這使得它們與其他生物成分一起擠出，但在體溫下交聯(lián)成穩(wěn)定的材料。微擠壓系統(tǒng)的高分辨率允許生物打印機(jī)精確地制造一些較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)多細(xì)胞模式的打印。
微擠壓生物打印技術(shù)的主要優(yōu)點是能夠沉積非常高的細(xì)胞密度。在組織工程器官中實現(xiàn)生理細(xì)胞密度是生物打印領(lǐng)域的一個主要目標(biāo)。一些研究小組使用僅由細(xì)胞組成的溶液，通過微擠壓打印技術(shù)創(chuàng)建出了一些三維組織結(jié)構(gòu)。尤其是無支架的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物打印最常用的技術(shù)就是機(jī)械微擠壓技術(shù)。微擠壓生物打印后細(xì)胞存活率低于噴墨生物打印。細(xì)胞存活率在40%-86%左右，隨著擠壓壓力的增大和噴嘴壓力的增大，細(xì)胞存活率逐漸降低。微擠壓沉積的細(xì)胞存活率下降可能是由于黏性流體中細(xì)胞受到剪應(yīng)力的作用。擠壓力對細(xì)胞活力的影響可能比噴嘴剪切力更大，使用低壓和大噴嘴大小雖然可以保持較高的細(xì)胞活力，但缺點可能損失其打印的分辨率和打印速度，而維持高存活率是實現(xiàn)組織功能的關(guān)鍵。雖然許多研究報告了打印后細(xì)胞存活能力的維持，但重要的是研究人員要證明這些細(xì)胞不僅存活，而且在組織結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其基本功能。
微擠壓生物打印已被用于制造多種組織類型，包括主動脈瓣、分支維管樹和體外藥動學(xué)以及腫瘤模型。雖然對于高分辨率的復(fù)雜結(jié)構(gòu)來說，制造時間可能會較慢，但已經(jīng)制造出了從臨床相關(guān)的組織到微流體室中的微組織等各種結(jié)構(gòu)。
3. 激光輔助生物打?。↙AB）
基于激光誘導(dǎo)的正向轉(zhuǎn)移這一原理。激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移技術(shù)最初是用來轉(zhuǎn)移金屬的，目前已成功地應(yīng)用于多肽、DNA和細(xì)胞等生物材料。雖然不像噴墨或微擠壓生物打印那么常見，但正在被越來越多地應(yīng)用于組織和器官工程研究中。這種打印機(jī)的工作原理是利用聚焦激光脈沖在色帶的吸收層上產(chǎn)生一個高壓氣泡，將含有細(xì)胞的材料推向下面的集電極基板。LAB的打印分辨率受許多因素的影響，包括激光強(qiáng)度(單位面積的能量傳遞)、表面張力、襯底的潤濕性以及生物層的厚度和粘度等。由于LAB是無噴嘴型的，所以困擾其他生物打印方式的細(xì)胞或材料堵塞問題在LAB中可以有效避免。LAB中細(xì)胞沉積密度高達(dá)108個（細(xì)胞/毫升），微尺度分辨率為單個細(xì)胞每滴，激光脈沖重復(fù)頻率為5kHz，打印速度則高達(dá)1600毫米/秒。對于細(xì)胞打印來說效率是非常高的。
每個打印單元或水凝膠類型通常都需要準(zhǔn)備單獨的色帶，這個準(zhǔn)備過程會非常耗時，并且如果多個單元類型和/或材料必須同時沉積，則這些單元的組合打印可能也會非常麻煩。另外，由于帶狀細(xì)胞涂層的性質(zhì)，很難準(zhǔn)確地定位細(xì)胞。其中一些挑戰(zhàn)可以通過使用細(xì)胞識別掃描技術(shù)來克服，使激光束能夠在每個脈沖中選擇一個細(xì)胞。這種所謂的“aim-and-shoot”程序可以確保每個打印的液滴包含預(yù)先定義的細(xì)胞數(shù)量。最后，由于印刷過程中金屬激光吸收層的蒸發(fā)，金屬殘留物出現(xiàn)在最終的生物打印結(jié)構(gòu)中。避免這種污染的方法包括使用非金屬吸收層和修改印刷工藝，使之不需要可吸收層。這些系統(tǒng)的高成本也是組織工程基礎(chǔ)研究的一個亟待解決的問題，但是與其他3D打印技術(shù)一樣，這些需求成本正在隨著科研技術(shù)的發(fā)展而迅速下降。
體內(nèi)LAB的應(yīng)用試驗已經(jīng)用于在小鼠顱骨三維缺陷模型中進(jìn)行納米羥基磷灰石的打印沉積中。另外，激光3D打印已經(jīng)被用于制造醫(yī)療設(shè)備，比如定制的、非細(xì)胞的、生物可吸收的氣管夾板，相應(yīng)產(chǎn)品已經(jīng)被植入一名患有局部氣管支氣管軟化癥的年輕患者體內(nèi)。未來的研究可能會使用可以直接整合到病人組織中的生物相容性材料。
結(jié)語：
3D生物打印組織結(jié)構(gòu)不僅可以用于移植，而且還可以用于新型藥物的發(fā)現(xiàn)，化學(xué)、生物和毒性分析以及相關(guān)的基礎(chǔ)研究。隨著研究人員不斷提高打印組織的復(fù)雜性，從二維組織，如皮膚，通過中空的管道如血管，中空的非管狀器官如膀胱以及整個器官如腎臟，這方面的研究工作者將不得不應(yīng)對日益艱巨的挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞和材料的需求，組織的生長和功能，以及適當(dāng)?shù)难芑蜕窠?jīng)支配等要求。這些挑戰(zhàn)需要多學(xué)科交叉的研究來應(yīng)對，3D生物打印技術(shù)將具有改造再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展速度和深度的無限潛力。
來源：思宇醫(yī)械觀察
