發(fā)布日期：2019-03-15
2019年3月15日，清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心施一公研究組就剪接體的機(jī)理與結(jié)構(gòu)研究，于《細(xì)胞》（Cell）雜志發(fā)表題為《催化激活狀態(tài)的酵母剪接體結(jié)構(gòu)揭示RNA剪接分支反應(yīng)的機(jī)理》（Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching）的科研論文，揭示了剪接體第一步剪接反應(yīng)前的瞬變狀態(tài)——催化激活剪接體（catalytically activated spliceosome，定義為“B*復(fù)合物”）4個(gè)不同構(gòu)象的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，這是目前RNA剪接循環(huán)中最后一個(gè)未被解析的基本狀態(tài)。至此，施一公研究組成為世界上首個(gè)、也是唯一一個(gè)成功捕獲并解析了RNA剪接過程中所有完全組裝剪接體高分辨率三維結(jié)構(gòu)系列成果的團(tuán)隊(duì)。該文報(bào)道的這4個(gè)同一狀態(tài)卻不同構(gòu)象的剪接體結(jié)構(gòu)，整體分辨率為2.9埃-3.8埃，核心區(qū)域的分辨率高達(dá)2.7埃，是目前報(bào)道的最高分辨率剪接體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)首次揭示了第一步剪接反應(yīng)發(fā)生過程中的動(dòng)態(tài)變化，展現(xiàn)了剪接因子對(duì)于剪接反應(yīng)發(fā)生的重要作用，第一次從結(jié)構(gòu)信息中回答了剪接體對(duì)不同pre-mRNA底物識(shí)別的特異性等重要科學(xué)問題。 1977年，科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)來自于腺病毒的mRNA與其對(duì)應(yīng)的DNA轉(zhuǎn)錄模板并不能形成連續(xù)的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環(huán)狀的DNA單鏈。這個(gè)重大發(fā)現(xiàn)表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上并不只是通過轉(zhuǎn)錄，還需要pre-mRNA剪接來進(jìn)一步完成“無效”遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。“無效”的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內(nèi)含子，而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子，內(nèi)含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進(jìn)化，含有內(nèi)含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應(yīng)增高，使得一個(gè)基因編碼多個(gè)蛋白質(zhì)成為可能，極大的豐富了蛋白質(zhì)組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。 RNA剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，其化學(xué)本質(zhì)是兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。這種看似簡單的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)胞中難以自行發(fā)生，而負(fù)責(zé)執(zhí)行這一化學(xué)反應(yīng)的是細(xì)胞核內(nèi)一個(gè)巨大且高度動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀(jì)初，科學(xué)家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質(zhì)譜、建立體外剪接反應(yīng)系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調(diào)控等復(fù)雜的RNA剪接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在剪接反應(yīng)過程中，多種蛋白-核酸復(fù)合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結(jié)合、重排和解聚，依次形成預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復(fù)合物）以及至少8個(gè)狀態(tài)的完全組裝剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復(fù)合物（圖1）。
圖1 RNA剪接示意圖（圖片來源: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.）
由于剪接體高度的動(dòng)態(tài)性和復(fù)雜性，獲得不同狀態(tài)的剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為世界難題。在這種巨大的挑戰(zhàn)下，施一公教授率領(lǐng)研究組迎難而上，經(jīng)過7年的努力，終于在2015年首次報(bào)道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結(jié)構(gòu)，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。這一重大研究成果對(duì)RNA剪接機(jī)理的研究產(chǎn)生革命性影響。自2015年第一個(gè)剪接體結(jié)構(gòu)發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體復(fù)合物處于8個(gè)不同狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，分別是3.8埃的預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預(yù)催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預(yù)催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態(tài)剪接體Bact complex、3.4埃的第一步催化反應(yīng)后剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后的剪接體P complex，以及3.5埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex的結(jié)構(gòu)。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個(gè)RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應(yīng)的工作機(jī)理，同時(shí)為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發(fā)生提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。然而，最后一個(gè)未被解析的完全組裝剪接體B* complex，對(duì)于理解第一步剪接反應(yīng)的發(fā)生具有至關(guān)重要的作用。由于其高度的動(dòng)態(tài)性與瞬時(shí)性，如何捕獲B* complex成為領(lǐng)域內(nèi)的一大難題，也是世界上不同課題組爭先解決的問題之一，捕獲并解析其結(jié)構(gòu)迫在眉睫。 盡管之前積累了大量剪接體結(jié)構(gòu)研究的經(jīng)驗(yàn)，施一公研究組在針對(duì)如何捕獲穩(wěn)定的B* complex時(shí)，卻是舉步維艱，困難重重。由于B* complex和C complex是第一步剪接反應(yīng)發(fā)生時(shí)一前一后的兩個(gè)狀態(tài)，領(lǐng)域內(nèi)對(duì)其鑒定的核心區(qū)別在于5’剪接位點(diǎn)與分支點(diǎn)之間的磷酸二脂鍵是否形成。因此，在不影響剪接體正常組裝和激活的前提下，如何阻止第一步反應(yīng)發(fā)生，并且保持5’剪接位點(diǎn)與分支點(diǎn)已經(jīng)進(jìn)入RNA剪接的活性反應(yīng)中心，并形成反應(yīng)前的活性位點(diǎn)，成為本文研究的最大難點(diǎn)。施一公研究組分別進(jìn)行了體內(nèi)內(nèi)源直接阻斷和體外建立剪接反應(yīng)阻斷等方法的嘗試，最終都無法獲得穩(wěn)定的B* complex樣品。在最新發(fā)表的這篇《細(xì)胞》文章中，施一公研究組將體內(nèi)阻斷與體外建立剪接反應(yīng)相結(jié)合，對(duì)提純方案多次探索，最終優(yōu)化出一套可以獲得穩(wěn)定的、性質(zhì)良好的B* complex樣品。為了探索剪接體對(duì)不同pre-mRNA底物的識(shí)別特異性，施一公研究組選取了領(lǐng)域內(nèi)常用的兩種pre-mRNA作為剪接體結(jié)合的底物，隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了4個(gè)不同構(gòu)象B* complex整體分辨率為2.9埃-3.8埃的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并搭建了原子模型，其中包含了4條RNA和35個(gè)蛋白（圖2）。
圖2 釀酒酵母催化激活剪接體4個(gè)構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)
該文解析的4個(gè)不同構(gòu)象的B* complex結(jié)構(gòu)，首次展示了RNA剪接第一步反應(yīng)發(fā)生過程中分支點(diǎn)如何被剪接體逐步“推入”活性反應(yīng)中心的動(dòng)態(tài)變化，其中第一步剪接因子Yju2在穩(wěn)定分支點(diǎn)中發(fā)揮了舉足輕重的作用，盡管此時(shí)5’剪接位點(diǎn)與分支點(diǎn)的距離十分接近（4.3埃），卻不足以形成磷酸二脂鍵。從而，該結(jié)構(gòu)也清晰地揭示了關(guān)鍵蛋白因子Cwc25在激發(fā)第一步剪接反應(yīng)中的重要作用（圖3）。值得一提的是，在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，第一次觀察到了pre-mRNA中分支點(diǎn)A被5’剪接位點(diǎn)GU通過經(jīng)典的堿基互補(bǔ)配對(duì)以及堿基堆積力共同識(shí)別的機(jī)制，這個(gè)結(jié)構(gòu)信息進(jìn)一步證明了該位點(diǎn)在真核生物中高度保守的重要性。本文另一大亮點(diǎn)是首次揭示了剪接體對(duì)不同pre-mRNA底物識(shí)別的特異性，為體內(nèi)不同pre-mRNA的剪接效率存在差異提供了最直接的結(jié)構(gòu)信息。
圖3 釀酒酵母剪接體介導(dǎo)分支反應(yīng)的模型
截至目前，施一公研究組在酵母中一共解析了10個(gè)不同狀態(tài)的剪接體高分辨的三維結(jié)構(gòu)（如圖4），成果全部發(fā)表于國際頂級(jí)期刊《科學(xué)》和《細(xì)胞》（Science 7篇，Cell 3篇），從組裝到被激活，從發(fā)生兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)發(fā)生到剪接體的解聚，這10個(gè)狀態(tài)的剪接體完整覆蓋了剪接通路，首次將剪接體介導(dǎo)的RNA剪接過程完整的串聯(lián)起來，為理解RNA剪接的分子機(jī)理提供了最清晰、最全面的結(jié)構(gòu)信息。
圖4 施一公研究組解析的酵母剪接體結(jié)構(gòu)匯總（圖片來源: https://ygshi.org/research）
十年一劍！施一公實(shí)驗(yàn)室就剪接體結(jié)構(gòu)研究揭示RNA剪接分子機(jī)理 清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心主任施一公教授為本文的通訊作者；清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后、高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者萬蕊雪、生命學(xué)院四年級(jí)博士研究生白蕊為該文的共同第一作者，清華大學(xué)生命學(xué)院博士后、高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者閆創(chuàng)業(yè)為結(jié)構(gòu)模型的搭建提供了幫助；清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心（北京）的支持。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心（清華）及國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。 原文鏈接 https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2 相關(guān)論文鏈接 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466 http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159 http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6 http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3 http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325
來源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心
