發(fā)布日期：2019-03-15
2019年3月15日，清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心施一公研究組就剪接體的機理與結構研究，于《細胞》（Cell）雜志發(fā)表題為《催化激活狀態(tài)的酵母剪接體結構揭示RNA剪接分支反應的機理》（Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching）的科研論文，揭示了剪接體第一步剪接反應前的瞬變狀態(tài)——催化激活剪接體（catalytically activated spliceosome，定義為“B*復合物”）4個不同構象的高分辨率三維結構，這是目前RNA剪接循環(huán)中最后一個未被解析的基本狀態(tài)。至此，施一公研究組成為世界上首個、也是唯一一個成功捕獲并解析了RNA剪接過程中所有完全組裝剪接體高分辨率三維結構系列成果的團隊。該文報道的這4個同一狀態(tài)卻不同構象的剪接體結構，整體分辨率為2.9埃-3.8埃，核心區(qū)域的分辨率高達2.7埃，是目前報道的最高分辨率剪接體結構，該結構首次揭示了第一步剪接反應發(fā)生過程中的動態(tài)變化，展現(xiàn)了剪接因子對于剪接反應發(fā)生的重要作用，第一次從結構信息中回答了剪接體對不同pre-mRNA底物識別的特異性等重要科學問題。 1977年，科學家們首次發(fā)現(xiàn)來自于腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉錄模板并不能形成連續(xù)的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環(huán)狀的DNA單鏈。這個重大發(fā)現(xiàn)表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上并不只是通過轉錄，還需要pre-mRNA剪接來進一步完成“無效”遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。“無效”的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內含子，而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子，內含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進化，含有內含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質成為可能，極大的豐富了蛋白質組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。 RNA剪接是真核生物基因表達調控的重要環(huán)節(jié)之一，其化學本質是兩步轉酯反應。這種看似簡單的化學反應在細胞中難以自行發(fā)生，而負責執(zhí)行這一化學反應的是細胞核內一個巨大且高度動態(tài)變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質譜、建立體外剪接反應系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調控等復雜的RNA剪接調控網絡。在剪接反應過程中，多種蛋白-核酸復合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結合、重排和解聚，依次形成預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復合物）以及至少8個狀態(tài)的完全組裝剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復合物（圖1）。
圖1 RNA剪接示意圖（圖片來源: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.）
由于剪接體高度的動態(tài)性和復雜性，獲得不同狀態(tài)的剪接體的高分辨率三維結構被公認為世界難題。在這種巨大的挑戰(zhàn)下，施一公教授率領研究組迎難而上，經過7年的努力，終于在2015年首次報道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結構，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結構。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產生革命性影響。自2015年第一個剪接體結構發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體復合物處于8個不同狀態(tài)的高分辨率結構，分別是3.8埃的預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態(tài)剪接體Bact complex、3.4埃的第一步催化反應后剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉酯反應后的剪接體P complex，以及3.5埃的內含子套索剪接體ILS complex的結構。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應的工作機理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發(fā)生提供結構依據(jù)。然而，最后一個未被解析的完全組裝剪接體B* complex，對于理解第一步剪接反應的發(fā)生具有至關重要的作用。由于其高度的動態(tài)性與瞬時性，如何捕獲B* complex成為領域內的一大難題，也是世界上不同課題組爭先解決的問題之一，捕獲并解析其結構迫在眉睫。 盡管之前積累了大量剪接體結構研究的經驗，施一公研究組在針對如何捕獲穩(wěn)定的B* complex時，卻是舉步維艱，困難重重。由于B* complex和C complex是第一步剪接反應發(fā)生時一前一后的兩個狀態(tài)，領域內對其鑒定的核心區(qū)別在于5’剪接位點與分支點之間的磷酸二脂鍵是否形成。因此，在不影響剪接體正常組裝和激活的前提下，如何阻止第一步反應發(fā)生，并且保持5’剪接位點與分支點已經進入RNA剪接的活性反應中心，并形成反應前的活性位點，成為本文研究的最大難點。施一公研究組分別進行了體內內源直接阻斷和體外建立剪接反應阻斷等方法的嘗試，最終都無法獲得穩(wěn)定的B* complex樣品。在最新發(fā)表的這篇《細胞》文章中，施一公研究組將體內阻斷與體外建立剪接反應相結合，對提純方案多次探索，最終優(yōu)化出一套可以獲得穩(wěn)定的、性質良好的B* complex樣品。為了探索剪接體對不同pre-mRNA底物的識別特異性，施一公研究組選取了領域內常用的兩種pre-mRNA作為剪接體結合的底物，隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了4個不同構象B* complex整體分辨率為2.9埃-3.8埃的冷凍電鏡結構，并搭建了原子模型，其中包含了4條RNA和35個蛋白（圖2）。
圖2 釀酒酵母催化激活剪接體4個構象的三維結構
該文解析的4個不同構象的B* complex結構，首次展示了RNA剪接第一步反應發(fā)生過程中分支點如何被剪接體逐步“推入”活性反應中心的動態(tài)變化，其中第一步剪接因子Yju2在穩(wěn)定分支點中發(fā)揮了舉足輕重的作用，盡管此時5’剪接位點與分支點的距離十分接近（4.3埃），卻不足以形成磷酸二脂鍵。從而，該結構也清晰地揭示了關鍵蛋白因子Cwc25在激發(fā)第一步剪接反應中的重要作用（圖3）。值得一提的是，在這個結構中，第一次觀察到了pre-mRNA中分支點A被5’剪接位點GU通過經典的堿基互補配對以及堿基堆積力共同識別的機制，這個結構信息進一步證明了該位點在真核生物中高度保守的重要性。本文另一大亮點是首次揭示了剪接體對不同pre-mRNA底物識別的特異性，為體內不同pre-mRNA的剪接效率存在差異提供了最直接的結構信息。
圖3 釀酒酵母剪接體介導分支反應的模型
截至目前，施一公研究組在酵母中一共解析了10個不同狀態(tài)的剪接體高分辨的三維結構（如圖4），成果全部發(fā)表于國際頂級期刊《科學》和《細胞》（Science 7篇，Cell 3篇），從組裝到被激活，從發(fā)生兩步轉酯反應發(fā)生到剪接體的解聚，這10個狀態(tài)的剪接體完整覆蓋了剪接通路，首次將剪接體介導的RNA剪接過程完整的串聯(lián)起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了最清晰、最全面的結構信息。
圖4 施一公研究組解析的酵母剪接體結構匯總（圖片來源: https://ygshi.org/research）
十年一劍！施一公實驗室就剪接體結構研究揭示RNA剪接分子機理 清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心主任施一公教授為本文的通訊作者；清華大學醫(yī)學院博士后、高精尖創(chuàng)新中心卓越學者萬蕊雪、生命學院四年級博士研究生白蕊為該文的共同第一作者，清華大學生命學院博士后、高精尖創(chuàng)新中心卓越學者閆創(chuàng)業(yè)為結構模型的搭建提供了幫助；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創(chuàng)新中心（清華）及國家自然科學基金委的經費支持。 原文鏈接 https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2 相關論文鏈接 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466 http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159 http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235 http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6 http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3 http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325
來源：結構生物學高精尖創(chuàng)新中心
