發(fā)布日期:2018-10-23
脊髓性肌萎縮癥(spinalmuscularatrophy,SMA)是一種常染色體隱性遺傳病,居兒童致死性常染色體隱性遺傳病的第2位。位于染色體5q11.2~q13.3上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(Survivalmotorneuron,SMN)是SMA的主要致病基因。
人基因組有兩個(gè)緊鄰的高度同源的SMN基因:端粒側(cè)的SMN1和著絲粒側(cè)的SMN2,兩者僅有5個(gè)堿基不同。SMN1是主要功能基因,該基因突變可導(dǎo)致SMA發(fā)病,SMN2為臨床表型的調(diào)節(jié)基因,影響病情的嚴(yán)重程度,其拷貝數(shù)增加可減輕SMA表型。目前已知約94%的SMA患者為SMN1基因第7和(或)第8外顯子純合缺失所致,少數(shù)病例可由SMN1基因點(diǎn)突變或小的缺失引起。
SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)的意義
SMA在人群中的發(fā)病率為1/5000~1/10000,群體攜帶者頻率為1/35~1/50,是出生缺陷的高危因素,因此極有必要進(jìn)行SMA攜帶者的人群篩查,并通過(guò)產(chǎn)前診斷技術(shù)降低人群中SMA患兒的出生率。
臨床上將SMA分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,即嬰兒型、中間型和少年型,嚴(yán)重程度依次遞減。神經(jīng)??漆t(yī)生一般根據(jù)患者發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展程度進(jìn)行臨床診斷,輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢,結(jié)合家族史和SMN1基因分析可進(jìn)行確診。由于SMA患兒中約94%為SMN1基因外顯子純合缺失,因此,SMN1基因缺失檢測(cè)對(duì)于SMA的診斷具有更高的靈敏度和特異性。且對(duì)不同型的SMA患者,SMN1純合缺失率沒(méi)有顯著差異,所以,SMN1純合缺失的檢測(cè)對(duì)于不同型SMA患者具有相同的臨床診斷價(jià)值。在歐美人群中,SMN1基因純合缺失檢測(cè)已成為診斷和排除診斷SMA的首選方法。
SMN1基因缺失檢測(cè)試劑的現(xiàn)狀
目前,SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)試劑較為缺乏,臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室較為公認(rèn)的方法是PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法。但該方法操作較為繁瑣,且重復(fù)性差,不利于標(biāo)準(zhǔn)化,不易推廣。同時(shí),這種方法只能檢測(cè)出純合缺失,無(wú)法確認(rèn)雜合缺失。
荷蘭的SMAMLPA檢測(cè)試劑可對(duì)待測(cè)靶序列進(jìn)行半定量分析,因此既可檢測(cè)純合缺失,亦可確認(rèn)雜合缺失。在國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用該方法進(jìn)行SMA患者診斷和SMA攜帶者篩查。但該產(chǎn)品目前仍為“僅用于研究”的試劑,尚未按照體外診斷類醫(yī)療器械上市(98/79/EC)。
2015年底,原國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局批準(zhǔn)了第一項(xiàng)SMN1缺失突變檢測(cè)試劑上市。該產(chǎn)品采用多重實(shí)時(shí)熒光MGB-TaqMan探針PCR法,以人基因組單拷貝基因RPP40為內(nèi)參基因,對(duì)SMN1基因第7外顯子和第8外顯子拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè),用于SMA患者的體外輔助分子診斷。SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)的難點(diǎn)之一在于排除高同源性基因SMN2的干擾,特別是對(duì)于SMN2高拷貝數(shù)的受試者,需保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。該產(chǎn)品通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量、絕對(duì)定量技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)整合,并在反應(yīng)體系中加入特定化學(xué)組分,以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶(C)與胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配,增加PCR擴(kuò)增的特異性,從而有效控制SMN2基因非特異性擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,準(zhǔn)確檢出高拷貝數(shù)SMN2樣本中SMN1基因第7和第8外顯子的缺失情況。
鑒于國(guó)內(nèi)外尚無(wú)任何按照體外診斷試劑批準(zhǔn)上市的SMA分子診斷產(chǎn)品,因此臨床試驗(yàn)方案中依據(jù)EMQN關(guān)于《SMA分子診斷最佳實(shí)踐指南》,采用了國(guó)內(nèi)外SMA體外輔助分子診斷領(lǐng)域公認(rèn)的PCR-RFLP法作為對(duì)照方法。臨床試驗(yàn)共完成1069例,其中正常對(duì)照組777例,SMA病例組292例,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比方法檢測(cè)結(jié)果的一致性為100%(95%置信區(qū)間:99.66%~100%)。此外,9747例正常成年人大樣本中目標(biāo)外顯子△△Ct分布范圍的調(diào)查亦顯示,該產(chǎn)品的純合突變判斷界值設(shè)置合理。
該試劑目前批準(zhǔn)的預(yù)期用途僅包含純合缺失的檢測(cè),尚不能用于雜合缺失的檢測(cè),因此無(wú)法用于SMA攜帶者的篩查,這是該產(chǎn)品的缺陷之一。
事實(shí)上,該產(chǎn)品在設(shè)計(jì)上已考慮到SMA攜帶者的檢測(cè),其檢測(cè)原理是以待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào)Ct值與內(nèi)參基因熒光信號(hào)Ct值之差(△Ct_s),與正常對(duì)照品三個(gè)梯度稀釋品中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào)Ct值和內(nèi)參基因熒光信號(hào)Ct值之差的平均值(△Ct_a)之差,即△△Ct,作為待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子拷貝數(shù)檢測(cè)變量(△△Ct=△Ct_s-△Ct_a)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量的基本數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)得到申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)變量△△Ct的計(jì)算公式,依據(jù)這一計(jì)算公式可推導(dǎo)出純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct理論值(或范圍);再結(jié)合目標(biāo)外顯子與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率差異以及SMN2不同拷貝數(shù)的影響,可對(duì)上述△△Ct理論值進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct值(或范圍)之間可設(shè)置合理的判斷界值,因此理論上該產(chǎn)品可分別檢測(cè)出三種基因狀態(tài)。但鑒于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)雜合缺失與野生型之間的判斷界值研究尚不透徹,再加上缺乏可判定雜合缺失的對(duì)比方法等其他困難,本次注冊(cè)申請(qǐng)的預(yù)期用途僅限于檢測(cè)純合突變,即SMA患者輔助診斷。
綜上,SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)在SMA疾病診斷和SMA攜帶者篩查中具有重要的臨床價(jià)值。然而到目前為止,受到技術(shù)水平的限制,相關(guān)的體外診斷試劑比較缺乏,特別是可用于SMA攜帶者篩查的雜合缺失檢測(cè),尚無(wú)適合的體外診斷試劑上市。(器審中心審評(píng)六部 何靜云)
來(lái)源:中國(guó)醫(yī)藥報(bào)