發(fā)布日期：2018-09-05
脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，居兒童致死性常染色體隱性遺傳病的第 2 位。位于染色體 5q11.2~q13.3 上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（Survival motor neuron，SMN）是 SMA 的主要致病基因。
人基因組有兩個(gè)緊鄰的高度同源的 SMN 基 因：端粒側(cè)的 SMN1 和著絲粒側(cè)的 SMN2，兩者僅有 5 個(gè)堿基不同。SMNl 是主要功能基因，該基因突變可導(dǎo)致 SMA 發(fā)病，SMN2為臨床表型的調(diào)節(jié)基因，影響病情的嚴(yán)重程度，其拷貝數(shù)增加可減輕SMA 表型。目前已知約 94％的 SMA患者為 SMNl 基因第 7 和（或）第 8外顯子純合缺失所致，少數(shù)病例可由SMN1 基因點(diǎn)突變或小的缺失引起。
SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)在 SMA 診斷中的意義
SMA 以脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性為特征，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱(chēng)性四肢近端和身體軀干肌肉無(wú)力、萎縮和癱瘓。根據(jù)發(fā)病年齡和肌無(wú)力嚴(yán)重程度，臨床上將 SMA 分為 I、Ⅱ和Ⅲ型，即嬰兒型、中間型和少年型，嚴(yán)重程度依次遞減。一般的，神經(jīng)專(zhuān)科醫(yī)生根據(jù)發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展程度進(jìn)行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結(jié)合家族史和 SMN1 基因分析可進(jìn)行確診。肌電圖是定位診斷，特異度不高；肌酶在鑒別其他肌無(wú)力疾病中有參考意義，但對(duì) SMA診斷無(wú)特異性；肌肉活檢由于取材的創(chuàng)傷性，患兒不易接受。由于 SMA患兒中約 94% 為 SMN1 基因外顯子純合缺失，因此 SMN1 基因缺失檢測(cè)對(duì)于 SMA 的診斷具有更高的靈敏度和特異性，且對(duì)不同型的 SMA 患者，SMN1 純合缺失率沒(méi)有顯著差異，也就是說(shuō) SMN1 純合缺失的檢測(cè)對(duì)于不同型 SMA 患者具有相同的臨床診斷價(jià)值；同時(shí)與有創(chuàng)的組織學(xué)診斷相比，基因檢測(cè)更易被接受。事實(shí)上，在歐美人群中，SMN1 基因純合缺失檢測(cè)已成為診斷和排除診斷 SMA 的首選方法。
SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)在產(chǎn)前診斷和篩查中的意義
SMA 在 人 群 中 的 發(fā) 病 率 為 1/5 000~1/10 000，群體攜帶者頻率為 1/35~1/50，是出生缺陷的高危因素。由于該病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，且基因位點(diǎn)明確，因此極有必要進(jìn)行SMA 攜帶者的人群篩查。通過(guò) SMN1基因外顯子雜合缺失突變的檢查可確認(rèn)無(wú)癥狀的攜帶者。當(dāng)夫妻雙方均為攜帶者時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行遺傳咨詢(xún)，評(píng)估生育患兒的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，并可以通過(guò)產(chǎn)前診斷技術(shù)降低人群中 SMA 患兒的出生率。在歐美等國(guó)家很早就建議在普通人群中進(jìn)行 SMA 攜帶者的篩查。
但在 SMA 患兒臨床診斷和 SMA攜帶者篩查中，對(duì) SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)的要求是截然不同的，前者僅需準(zhǔn)確檢測(cè)出 SMN1 基因外顯子純合缺失，后者則需要鑒別 SMN1 基因外顯子雜合缺失。
SMN1 基因缺失檢測(cè)試劑的現(xiàn)狀
目前，SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)試劑較為缺乏。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室較為公認(rèn)的方法是 PCR 結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法，但該方法操作較為繁瑣，且重復(fù)性差，不利于標(biāo)準(zhǔn)化，不易推廣。這種方法只能檢測(cè)出純合缺失，無(wú)法確認(rèn)雜合缺失。
荷蘭的 SMA MLPA 檢測(cè)試劑可對(duì)待測(cè)靶序列進(jìn)行半定量分析，因此既可檢測(cè)純合缺失，亦可確認(rèn)雜合缺失。在國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用該方法進(jìn)行 SMA 患者診斷和 SMA 攜帶者篩查。但該產(chǎn)品目前仍為“僅用于研究”的試劑，尚未按照體外診斷類(lèi)醫(yī)療器械上市（98/79/EC）。
2015 年底，CFDA 批準(zhǔn)了第一項(xiàng)SMN1 缺失突變檢測(cè)試劑上市。該產(chǎn)品采用多重實(shí)時(shí)熒光 MGB-TaqMan探針 PCR 法，以人基因組單拷貝基因 RPP40 為內(nèi)參基因，對(duì) SMN1 基因第 7 外顯子和第 8 外顯子拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，用于脊肌萎縮癥（SMA）患者的體外輔助分子診斷。SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)的難點(diǎn)之一在于排除高同源性基因 SMN2 的干擾，特別是對(duì)于 SMN2 高拷貝數(shù)的受試者，需保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。該產(chǎn)品通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光 PCR 相對(duì)定量、絕對(duì)定量技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)整合，并在反應(yīng)體系中加入特定化學(xué)組份，以抑制PCR 引物 3’端的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的錯(cuò)配，增加 PCR 擴(kuò)增的特異性，從而有效控制 SMN2 基因非特異性擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，準(zhǔn)確檢出高拷貝數(shù) SMN2 樣本中 SMN1基因第7外顯子和第 8外的缺失情況。
鑒于國(guó)內(nèi)外尚無(wú)任何按照體外診斷試劑批準(zhǔn)上市的SMA 分子診斷產(chǎn)品，因此臨床試驗(yàn)方案中依據(jù) EMQN 關(guān)于《SMA 分子診斷最佳實(shí)踐指南》，采用了國(guó)內(nèi)外SMA 體外輔助分子診斷領(lǐng)域公認(rèn)的PCR-RFLP 法作為對(duì)照方法。臨床試驗(yàn)共完成 1069 例，其中正常對(duì)照組777 例，SMA 病例組 292 例，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比方法檢測(cè)結(jié)果的一致性為 100%（95% 置信區(qū)間：99.66%-100%）。 此外，9747例正常成年人大樣本中目標(biāo)外顯子△△ Ct 分布范圍的調(diào)查亦顯示，該產(chǎn)品的純合突變判斷界值設(shè)置合理。
該試劑目前批準(zhǔn)的預(yù)期用途僅包含純合缺失的檢測(cè)，尚不能用于雜合缺失的檢測(cè)。因此無(wú)法用于 SMA攜帶者的篩查。這是該產(chǎn)品的缺陷之一。但事實(shí)上該產(chǎn)品在設(shè)計(jì)上已考慮到 SMA 攜帶者的檢測(cè)。該產(chǎn)品的檢測(cè)原理是以待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào) Ct 值與內(nèi)參基因熒光信號(hào) Ct 值之差（△ Ct_s），與正常對(duì)照品三個(gè)梯度稀釋品中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào) Ct 值與內(nèi)參基因熒光信號(hào) Ct 值之差的平均值（△ Ct_a）之差，即△△ Ct，作為待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子拷貝數(shù)檢測(cè)變量（△△ Ct= △ Ct_s - △ Ct_a）。 依據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相對(duì)定量的基本數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)得到申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)變量△△ Ct 的計(jì)算公式，依據(jù)這一計(jì)算公式可推導(dǎo)出純合缺失、雜合缺失和野生型的△△ Ct 理論值（或范圍）；再結(jié)合目標(biāo)外顯子與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率差異以及 SMN2 不同拷貝數(shù)的影響，可對(duì)上述△△ Ct 理論值進(jìn)行優(yōu)化；結(jié)果顯示純合缺失、雜合缺失和野生型的△△ Ct 值（或范圍）之間可設(shè)置合理的判斷界值，因此理論上該產(chǎn)品可分別檢測(cè)出三種基因狀態(tài)。但鑒于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)雜合缺失與野生型之間的判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可判定雜合缺失的對(duì)比方法等其他困難，本次注冊(cè)申請(qǐng)的預(yù)期用途僅限于檢測(cè)純合突變，即 SMA 患者輔助診斷。
小結(jié)
綜上，SMN1 基因外顯子缺失檢測(cè)在 SMA 疾病診斷和 SMA 攜帶者篩查中具有重要的臨床價(jià)值。然而到目前為止，受到技術(shù)水平的限制，相關(guān)的體外診斷試劑比較缺乏，特別是可用于 SMA 攜帶者篩查的雜合缺失檢測(cè)，尚無(wú)適合的體外診斷試劑上市。（審評(píng)六部 何靜云 供稿）
參考文獻(xiàn)：
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來(lái)源：中國(guó)器審
