發(fā)布日期：2018-08-21
一陣濃郁的蕉香襲擊著黑暗中的一只果蠅，它“嗡嗡”地興奮起來(lái)，振翅要湊過(guò)去?？萍既?qǐng)?bào)記者近日走訪北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)現(xiàn)，研究人員正在試圖捕捉這只被釘在顯微鏡下的果蠅的“思想活動(dòng)”。“我們可以直接觀測(cè)到，果蠅感應(yīng)到氣味之后，腦中的多巴胺濃度變化。”正在做實(shí)驗(yàn)的博士生曾健智說(shuō)，“一會(huì)兒還會(huì)給它一些電信號(hào)刺激，觀察腦中多巴胺在不同刺激下的響應(yīng)。”
“聞香起舞”這個(gè)簡(jiǎn)單的畫面在“腦圖譜”的維度是復(fù)雜的——香蕉揮發(fā)出的香氣分子被果蠅的嗅覺(jué)細(xì)胞捕獲，激發(fā)了嗅覺(jué)細(xì)胞通路中的信號(hào)轉(zhuǎn)換，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)電信號(hào)傳送至腦，電信號(hào)的到來(lái)催促著體內(nèi)多巴胺的分泌，通過(guò)打開(kāi)細(xì)胞內(nèi)的通路，將神經(jīng)信號(hào)中氣味分子的信息傳遞出來(lái)。
如同“多米諾骨牌”，外界的刺激一張張傳遞下去，激起了生物體的反應(yīng)。由于多年來(lái)對(duì)活體動(dòng)物思維的即時(shí)、定位觀測(cè)始終未能實(shí)現(xiàn)，這些反應(yīng)具體發(fā)生在大腦中的哪個(gè)部分，人類仍無(wú)從得知。日前，新一期《細(xì)胞》雜志刊登了北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員李毓龍團(tuán)隊(duì)的研究成果：通過(guò)基因構(gòu)建的方法，他們開(kāi)發(fā)出多巴胺熒光探針，宛如在深邃的思想迷宮中點(diǎn)燃“火把”，為此類相關(guān)研究“照亮”了多巴胺神經(jīng)環(huán)路。
動(dòng)態(tài)示蹤多巴胺信號(hào)變化
“將水母中的熒光基因和人源G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）基因聯(lián)合在一起，我們獲得了可以動(dòng)態(tài)示蹤多巴胺的工具。”李毓龍告訴科技日?qǐng)?bào)記者，這聽(tīng)起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是神經(jīng)活動(dòng)的特性對(duì)探針提出了嚴(yán)苛要求。神經(jīng)活動(dòng)是稍縱即逝的，它必須反應(yīng)迅速；多巴胺的生成可能是痕量的，因此它必須敏銳；示蹤多巴胺必須可信不“犯錯(cuò)”，它必須準(zhǔn)確無(wú)誤……只有符合這些鐵一般的律條，才具備資格成為廣泛應(yīng)用的研究工具。
打磨工具的“原材料”正是能夠和多巴胺結(jié)合的GPCR。“它是一個(gè)跨膜蛋白，它在結(jié)合多巴胺后會(huì)引發(fā)自身的構(gòu)象變化，我們想，如果能夠讓這樣的構(gòu)想變化產(chǎn)生熒光，或能解決問(wèn)題。”論文第一作者之一的北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士井淼解釋道。這可以通俗地比喻為，多巴胺“按下”的按鍵此前只打開(kāi)了大門，而要打造的新工具能讓打開(kāi)的大門同時(shí)亮燈。
為此，團(tuán)隊(duì)選擇了5種GPCR亞型作為備選原材料。“我們利用分子克隆的方法將編碼熒光蛋白的基因與五種多巴胺受體的基因拼接起來(lái)，通過(guò)對(duì)融合蛋白的表達(dá)、定位及受體對(duì)多巴胺的親和力等指標(biāo)篩選出最好的亞型。”井淼說(shuō)。
人工“拼接”后的基因表達(dá)會(huì)不會(huì)被細(xì)胞“認(rèn)可”？打造一款高效“探針”的第一個(gè)阻礙來(lái)自細(xì)胞內(nèi)部。“正常的GPCR是膜蛋白，要檢測(cè)細(xì)胞外出現(xiàn)的多巴胺信號(hào)，蛋白必須要上膜，加了熒光蛋白以后，GPCR的性質(zhì)可能會(huì)變化，無(wú)法上膜。”井淼說(shuō)。
精密運(yùn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞在“零件”被改變之后能否正常運(yùn)轉(zhuǎn)、經(jīng)過(guò)修飾的全新蛋白能否“繼承”原有的功能、基因遵循密碼子原則轉(zhuǎn)錄翻譯為氨基酸序列之后的蛋白裝配是否能完成抵達(dá)細(xì)胞膜發(fā)揮作用的任務(wù)等都是擺在課題組面前的“攔路虎”。
抵達(dá)膜上僅僅是第一步。“要想GPCR接受信號(hào)分子多巴胺后產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)牽動(dòng)熒光蛋白扭轉(zhuǎn)后發(fā)光，兩個(gè)蛋白的連接方式起決定作用。”井淼解釋，“有的情況下，受體的構(gòu)象改變可能無(wú)法有效傳遞給熒光蛋白以產(chǎn)生熒光變化。”
知己知彼，百戰(zhàn)百勝。由于對(duì)GRCR蛋白三維構(gòu)象、核心基團(tuán)、結(jié)構(gòu)作用力等的精準(zhǔn)了解，李毓龍團(tuán)隊(duì)對(duì)其基因水平上的改造和雕琢，能夠做到恰到好處。實(shí)驗(yàn)證明，長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)該探針對(duì)模式生物的生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯影響。利用該探針，他們檢測(cè)到了電刺激小鼠腦片引發(fā)的多巴胺釋放，并在活體果蠅、斑馬魚和小鼠的大腦中檢測(cè)到了與嗅覺(jué)刺激、視覺(jué)刺激、學(xué)習(xí)記憶、交配行為相關(guān)的多巴胺信號(hào)變化。
精益求精，探針靈敏度不斷“進(jìn)化”
“人們可能從來(lái)不知道這里有神經(jīng)信號(hào)釋放，但是如果有一個(gè)非常靈敏的探針，就可能會(huì)看到。”井淼說(shuō)，文章接收后，團(tuán)隊(duì)始終在進(jìn)行探針的優(yōu)化工作，如今的探針比論文中的更加靈敏。
如果將人腦比喻成一張聯(lián)絡(luò)圖，科學(xué)家想要做的是按圖索驥，尋找例如記憶、情感等對(duì)應(yīng)的神經(jīng)活動(dòng)的詳細(xì)內(nèi)容。而未來(lái)這張圖的清晰度如何，是雪花、省流、標(biāo)清、高清還是1080P，則完全取決于探針的靈敏度。
在突破了第一個(gè)阻礙之后，探針迎來(lái)了“修煉式”優(yōu)化。“我們知道要把熒光蛋白的基因和特定的GPCR基因連在一起，可是怎么連才最優(yōu)呢？”井淼說(shuō)，靠左一點(diǎn)還是靠右一點(diǎn)，也可能需要在中間加一座連接的橋梁，橋梁又該怎么設(shè)計(jì)，這其中能排列組合出的方案數(shù)不勝數(shù)。
“我們通過(guò)找到一些對(duì)探針與多巴胺反應(yīng)起到關(guān)鍵作用的位點(diǎn)，對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，取得了探針優(yōu)化的效果。”井淼介紹，實(shí)驗(yàn)中突變帶來(lái)的結(jié)果可能有好有壞，突變后會(huì)測(cè)試其與多巴胺的反應(yīng)，篩選出“改良版”，這些“改良版”隨后還會(huì)進(jìn)行組合嘗試，不斷篩選與優(yōu)化，向著更高的靈敏度“進(jìn)化”。經(jīng)過(guò)500多個(gè)突變的嘗試，團(tuán)隊(duì)最終獲得了具有高、低親和力的兩種版本探針，適用于多巴胺釋放量不同的腦區(qū)。
李毓龍認(rèn)為，探針靈敏度在未來(lái)的持續(xù)優(yōu)化和篩選中將可能不斷提高，使其有能力示蹤更多未知的神經(jīng)通路，發(fā)現(xiàn)人類不曾觀測(cè)到、還不知曉的神經(jīng)系統(tǒng)秘密。
捕捉神經(jīng)活動(dòng)，從“閃爍”變?yōu)?ldquo;多彩”
由于神經(jīng)元在放電的時(shí)候會(huì)爆發(fā)出一個(gè)短暫的鈣離子濃度高峰，神經(jīng)元鈣離子成像技術(shù)至今依然是人們觀測(cè)神經(jīng)活動(dòng)最為直接的手段。“雖然鈣離子成像能夠同時(shí)反應(yīng)成百上千個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)，但由于許多神經(jīng)遞質(zhì)都可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的變化，因此單純通過(guò)鈣成像難以知曉是何種神經(jīng)遞質(zhì)在發(fā)揮作用。”井淼說(shuō)。
有文章評(píng)價(jià)，有了鈣成像技術(shù)，原本悄無(wú)聲息的神經(jīng)活動(dòng)就變成了一幅閃爍的壯觀影像。然而這種“全面開(kāi)花”的成像方式難以“定點(diǎn)”“定性”反應(yīng)精細(xì)的問(wèn)題。
“神經(jīng)元的興奮性變化是否是多巴胺介導(dǎo)的？是某一個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞始終分泌了多巴胺，還是分階段分泌不同濃度的多巴胺？是一整個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的活動(dòng)，還是神經(jīng)元細(xì)胞中不同突觸的活動(dòng)？回答這些問(wèn)題，才有可能弄清一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理，從而有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)藥物。”李毓龍說(shuō)。
如果說(shuō)，鈣離子成像技術(shù)解決的是科學(xué)家終于可以“目擊”神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中往來(lái)穿梭的問(wèn)題，那么多巴胺熒光探針技術(shù)解決的是逐一“狙擊”神經(jīng)信號(hào)與現(xiàn)實(shí)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
與此同時(shí)，李毓龍團(tuán)隊(duì)還首次成功開(kāi)發(fā)了靈敏、特異、可遺傳編碼的乙酰膽堿熒光探針，并成功在不同生物體系中實(shí)時(shí)檢測(cè)內(nèi)源乙酰膽堿信號(hào)，相關(guān)論文日前已在《自然·生物技術(shù)》雜志發(fā)表?？梢韵胍?jiàn)，當(dāng)每一種神經(jīng)遞質(zhì)有一個(gè)不同顏色的探針對(duì)應(yīng)，那神經(jīng)活動(dòng)將從之前的“閃爍”變?yōu)?ldquo;多彩”，不同顏色代表不同的神經(jīng)活動(dòng)。有了趁手的工具，人們將在獲得“腦圖譜”的研究中邁進(jìn)一大步。（記者 張佳星）
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