發(fā)布日期:2018-06-21
5月 31日,國(guó)際學(xué)術(shù)期刊 Nucleic Acids Research 在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心 / 植物生理生態(tài)研究所李軒研究組合作完成的題為 Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing 的研究論文。該工作報(bào)道了一個(gè)利用新發(fā)現(xiàn) CRISPR 家族中的 Cas13 蛋白(VI 型)及其指導(dǎo) RNA(guide RNA)靶向結(jié)合特異序列單鏈 RNA 的能力,通過(guò)設(shè)計(jì)改造并與人源的 RNA 脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域(hADAR2d)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了精確定點(diǎn) RNA(A→I)編輯的人工機(jī)器。與近年來(lái)利用 CRISPR 家族蛋白(例如 Cas9)對(duì) DNA 編輯來(lái)修改基因 / 調(diào)控基因表達(dá)不同,Cas13 體系不涉及編碼基因 DNA 的改變,而是通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)進(jìn)行編輯,為改變基因功能和調(diào)控表達(dá)提供了新的方法和思路。
近年來(lái)利用 CRISPR 技術(shù)對(duì)生物物種基因 DNA 的編輯(包括切割和堿基替換),獲得了巨大的成功,同時(shí)也面臨技術(shù)上的限制。與 DNA 編輯技術(shù)互補(bǔ),一個(gè)針對(duì) RNA 的精確定點(diǎn)編輯技術(shù),有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用。與 DNA 編輯技術(shù)相比,RNA 的定點(diǎn)編輯不改變編碼基因本身(DNA 堿基改變后不能逆轉(zhuǎn)),在時(shí)間上、空間上和效率上更加可控。同時(shí),RNA 編輯可以同時(shí)修改多個(gè)基因、同時(shí)靶向多拷貝基因的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(尤其是對(duì)多倍體的物種),所以更加高效。在對(duì)疾病的基因治療領(lǐng)域,利用 RNA 定點(diǎn)編輯修復(fù)疾病組織的突變基因,有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
為了實(shí)現(xiàn)精確定點(diǎn) RNA 編輯的人工機(jī)器,李軒研究組與研究員楊晟、中科院上海巴斯德研究所研究員郝沛及美國(guó)密歇根大學(xué)教授王紅兵合作,對(duì)新發(fā)現(xiàn) CRISPR 家族中具有結(jié)合特異序列單鏈 RNA 能力的 Cas13a,首先在模式生物裂殖酵母(S pombe)中實(shí)現(xiàn)了其靶向內(nèi)源 RNA 和降解靶標(biāo) RNA 的功能。進(jìn)一步,設(shè)計(jì) 利用 Cas13a 的改造產(chǎn)物 dCas13a(喪失 RNA 切割活性的突變),將 dCas13a 與人源的 RNA 腺嘌呤脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域(hADAR2d)融合,引入到裂殖酵母中;再通過(guò)設(shè)計(jì) RNA 編輯機(jī)器的靶向“零件”指導(dǎo) RNA,實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源 RNA 的精確定點(diǎn)編輯。為了對(duì) RNA 定點(diǎn)編輯機(jī)器的設(shè)計(jì)和參數(shù)(編輯堿基位置、距離、指導(dǎo) RNA 結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度等)進(jìn)行優(yōu)化,研究人員構(gòu)建了一系列不同的設(shè)計(jì),并利用一個(gè)雙熒光報(bào)告(reporter)系統(tǒng)來(lái)測(cè)試不同設(shè)置的編輯效率,從而獲得了精準(zhǔn) RNA 編輯機(jī)器的最優(yōu)參數(shù)。優(yōu)化后的編輯機(jī)器對(duì)內(nèi)源靶標(biāo) RNA 的編輯效率達(dá)到了 59%。最后,該研究實(shí)現(xiàn)的精準(zhǔn) RNA 編輯機(jī)器的功能,進(jìn)一步體現(xiàn)在對(duì)裂殖酵母反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 Tf1 突變株的修復(fù)和操作的實(shí)驗(yàn)中。Tf1 與動(dòng)物細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒類似,其跳躍和擴(kuò)增需要經(jīng)過(guò)中間體 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄步驟。研究人員利用精準(zhǔn) RNA 編輯,恢復(fù)了 Tf1 突變株的轉(zhuǎn)座能力,這個(gè)應(yīng)用對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒干預(yù)和操作提供了一個(gè)有潛力的工具。
該研究主要由荊新云和解冰冉等人完成。相關(guān)工作得到了中國(guó)農(nóng)業(yè)部項(xiàng)目、國(guó)家科技重大專項(xiàng)和自然科學(xué)基金項(xiàng)目的支持。
來(lái)源:上海生命科學(xué)研究院