發(fā)布日期：2017-12-28
在中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組用于研究的養(yǎng)豬場(chǎng)里，生活著一群特別的豬。這里不僅有十幾頭帶有基因剪刀的工具豬，而且擁有六七百頭其他在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值的基因修飾豬。而這些豬的用途聽起來(lái)更加“駭人”，有些基因修飾豬可以模擬人類疾病，如老年癡呆癥、漸凍人癥和亨廷頓舞蹈癥等，有些豬可為人體器官移植提供異種器官來(lái)源。
異種器官移植一直是國(guó)際研究的重點(diǎn)方向之一。如果這一重大難關(guān)能夠攻克，將會(huì)為全世界需要器官移植的上百萬(wàn)病人帶來(lái)希望。
令人興奮的是，這道通往希望的大門正在悄然打開——不久前，賴良學(xué)課題組在國(guó)際權(quán)威雜志《基因組研究》上發(fā)表了一篇關(guān)于構(gòu)建了條件性表達(dá)Cas9基因新型工具豬模型的論文。
廣州生物院首次培育出的帶有基因剪刀的工具豬 廣州生物院首次培育出的帶有基因剪刀的工具豬
為何選擇豬
要了解這項(xiàng)研究，先得從Cas9基因說(shuō)起。
Cas9基因與CRISPR技術(shù)曾經(jīng)在寨卡病毒暴發(fā)時(shí)大顯身手，被用于監(jiān)測(cè)寨卡病毒，甚至還能用來(lái)檢測(cè)SARS、SARS冠狀病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒等。前者是基因中的一種核酸酶，后者則是“規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)”的英文縮寫，來(lái)自細(xì)菌體內(nèi)，肩負(fù)著細(xì)菌免疫的“重任”。
在CRISPR利用病毒DNA自行轉(zhuǎn)化后驅(qū)逐這種病毒的過(guò)程中，Cas9是關(guān)鍵的核酸酶。不過(guò)這次，兩者聯(lián)手卻不是要檢測(cè)病毒，而是被研究人員在豬身上“埋入”一個(gè)可以世代遺傳的“秘密”，讓它肩負(fù)起更大的使命。
這個(gè)秘密就是研究人員通過(guò)定點(diǎn)修改豬的基因組，為實(shí)驗(yàn)打開“方便之門”。
一直以來(lái)，醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的犧牲。這是因?yàn)橐@得有關(guān)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的新知識(shí)或解決具體問(wèn)題，人類無(wú)法在自身上實(shí)驗(yàn)，只能在實(shí)驗(yàn)室使用動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究。
在用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中，既有小鼠、大鼠、兔子等小動(dòng)物，也有豬、猩猩、狒狒等大動(dòng)物。不過(guò)，因?yàn)榇髣?dòng)物的孕育期、生長(zhǎng)期和性成熟期較長(zhǎng)，不如小鼠、大鼠、兔子等小動(dòng)物繁殖時(shí)間短。“如果做基因?qū)嶒?yàn)，就需要在胚胎期間更改基因，再放入代孕母體內(nèi)，等待降生。”賴良學(xué)告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》記者，“小鼠的孕期是21天，4周可性成熟，繼續(xù)繁殖下一代。但豬的孕期就有114天左右，性成熟期則需要6~8個(gè)月。”所以研究人員往往會(huì)選擇孕育期較短的小型動(dòng)物，以便早日看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
只是，使用小型動(dòng)物雖然縮短了時(shí)間，卻因?yàn)樾⌒蛣?dòng)物與人體的差別較大，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往無(wú)法直接用在人身上。那么誰(shuí)可以肩負(fù)重任，與人類相近，讓實(shí)驗(yàn)更接近于真實(shí)呢？
在眾多哺乳動(dòng)物中，豬雖然與人的血緣不近，但其器官大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝和免疫系統(tǒng)等與人類非常接近；再者，豬是人類飼養(yǎng)的家畜，數(shù)量比狒狒、猩猩等靈長(zhǎng)類動(dòng)物更多，沒(méi)有倫理方面的障礙，所以豬是目前比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
但問(wèn)題是，如果想根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康那玫羝渲刑囟ɑ?，研究人員又必須從動(dòng)物胚胎期開始實(shí)施，待到動(dòng)物被孕育出來(lái)才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這樣不僅延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且因?yàn)榕嘤^(guò)程復(fù)雜，成功率比較低，導(dǎo)致開銷很大。
從事基因修飾克隆豬研究近20年的賴良學(xué)，意識(shí)到如果培育一種能夠在體內(nèi)直接進(jìn)行基因編輯的工具豬就可以解決上述問(wèn)題。
2018（第二屆）模式動(dòng)物與重大疾病動(dòng)物模型研究與應(yīng)用研討會(huì)
中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院博士、論文第一作者王可品在接受《中國(guó)科學(xué)報(bào)》記者采訪時(shí)解釋說(shuō)：“我們?cè)O(shè)想可以通過(guò)基因編輯技術(shù)，將能夠切割基因組的蛋白基因加入到豬的基因組，這樣就等于在豬的體內(nèi)插入了一把基因剪刀。”而且，通過(guò)體細(xì)胞克隆獲得這種帶有基因剪刀的第一代工具豬，還能通過(guò)簡(jiǎn)單的配種實(shí)現(xiàn)世代遺傳，形成帶有基因剪刀的豬種群。這樣實(shí)驗(yàn)人員就可直接在成年豬身上做實(shí)驗(yàn)，而不必再?gòu)呐咛テ谧銎?，從而?jiǎn)化并大大地加快實(shí)驗(yàn)流程。
四年的堅(jiān)守
找到了研究方向后，2013年，賴良學(xué)又帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)巧妙地設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案，接下來(lái)的任務(wù)，便是向著目標(biāo)不斷前行。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員利用基因打靶技術(shù)，將能夠剪開基因的Cas9蛋白基因插入到豬基因組的特定位點(diǎn)ROSA26。“Cas9蛋白作為剪刀，預(yù)先埋入豬基因中。不過(guò)為了防止Cas9亂剪，所以又加入了開關(guān)。”賴良學(xué)解釋說(shuō)。
控制這一開關(guān)的關(guān)鍵是Cre重組酶。Cre（Cyclization Recombination Enzyme，即環(huán)化重組酶）是來(lái)源于噬菌體P1的一種酶蛋白，它可以識(shí)別催化基因中兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生同源重組，從而造成DNA的缺失、易位等現(xiàn)象。這一特性在基因工程操作中得到廣泛的應(yīng)用，尤其在誘導(dǎo)型基因剔除小鼠的建立中應(yīng)用得十分成功。
那么，將這一技術(shù)應(yīng)用到豬身上能否獲得成功呢？“我們做得很順利，因?yàn)槲覀儺?dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得比較好，所以第一代豬孕育出來(lái)時(shí)就得到了想要的結(jié)果。”賴良學(xué)回憶說(shuō)。
其實(shí)，實(shí)驗(yàn)之所以如此順利，也得益于賴良學(xué)多年的“修煉”。他自2007年回國(guó)之后，一直從事基因修飾豬模型的構(gòu)建，在這以前在多種基因修飾豬方面都取得了重大突破，良好的基礎(chǔ)保證了此工具豬實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
王可品是賴良學(xué)課題組一名碩博連讀的研究生，他還清晰地記得，2015年4月份的一天，克隆的工具豬誕生。“小豬生出來(lái)是下午兩三點(diǎn)，我們需要通過(guò)分子實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證小豬是否是我們需要的工具豬。”為了盡快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，王可品與其他研究人員一起在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行鑒定。
那一夜注定無(wú)眠。王可品和同事從下午一直忙碌到第二天清晨九點(diǎn)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，他們特別興奮——他們成功了！
不論是第一代，還是由之繁殖起來(lái)的后代工具豬，外表和其他功能與正常家豬并無(wú)不同。“它們不會(huì)出現(xiàn)特異性疾病。”賴良學(xué)說(shuō)。
關(guān)鍵是，在配種時(shí)，如果公豬與母豬只有一方進(jìn)行了基因修飾，那么后代并非所有都會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性；如果公豬與母豬雙方都完成了基因修飾，那么所孕育的全部后代會(huì)100%繼承這一基因。
這意味著，實(shí)驗(yàn)人員在使用工具豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，不需要每次都對(duì)豬的基因組進(jìn)行修飾，只需要在第一代即F0代豬的基因組特定位點(diǎn)插入Cas9蛋白基因，就可以依靠豬的自然繁殖得到同等類型的“天生自帶基因剪刀”的豬，即工具豬。
這只是開始
在等待工具豬的繁育結(jié)果過(guò)程中，賴良學(xué)還將這一技術(shù)用在狗身上。2015年，賴良學(xué)帶領(lǐng)另一隊(duì)研究人員，在狗的胚胎期使用了同樣的方法，即敲掉了其中的一部分基因。這讓被孕育出的小狗呈現(xiàn)出肌肉更發(fā)達(dá)、運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)的特點(diǎn)。
因?yàn)楣吩跔I(yíng)養(yǎng)代謝、生理解剖、心血管系統(tǒng)等方面與人類極其相似，且狗較為聰明，所以會(huì)被用來(lái)進(jìn)行行為學(xué)研究，適合建立帕金森氏綜合征、老年癡呆等狗模型來(lái)研究人類疾病。當(dāng)然，狗作為寵物，通過(guò)基因敲除來(lái)研究培育還可以用來(lái)優(yōu)良遺傳性狀。
在工具豬繁育出后代以后，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)的研究人員又圍繞其潛在的應(yīng)用價(jià)值展開了研究。他們首先想到的是利用基因剪刀工具豬制備原發(fā)性癌癥模型。
以前制備用于腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和藥物研發(fā)的腫瘤模型大多是將人的腫瘤細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。“裸鼠是在胚胎期完全敲掉所有與免疫力相關(guān)的基因誕生的鼠類，即一出生就不帶任何免疫力。”賴良學(xué)進(jìn)一步解釋說(shuō)，“以這種方式制備的小鼠腫瘤模型，一方面因?yàn)闆](méi)有免疫能力，另一方面，不是原發(fā)性腫瘤，因此與人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大的差別，用它對(duì)腫瘤藥物進(jìn)行有效性和安全性檢測(cè)的結(jié)果95%以上不能轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。”
研究人員將包裝含有Cre重組酶和靶向六種腫瘤相關(guān)基因的gRNAs慢病毒通過(guò)滴鼻方式，感染工具豬的肺臟，即讓豬肺細(xì)胞的基因組發(fā)生癌化突變。果然，三個(gè)月后，該工具豬出現(xiàn)了典型的肺癌癥狀和病理變化，從而成功地建立了原發(fā)性肺腫瘤大動(dòng)物模型。
“這種工具豬可在癌癥研究中發(fā)揮重要作用，因?yàn)榘┌Y本身就是基因突變。”賴良學(xué)解釋說(shuō)。也因此，人體身上的其他癌癥也可以通過(guò)類似的方式作用在工具豬上被復(fù)制出。
“以前，一個(gè)大型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)就需要花費(fèi)上百萬(wàn)元，現(xiàn)在有了工具豬，不僅縮短了時(shí)間，費(fèi)用降低到幾萬(wàn)元即可。”賴良學(xué)表示。
讓異體移植離臨床更近
無(wú)疑，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)的研究使異種器官移植往前邁入一大步。
眾所周知，異種器官移植是國(guó)際研究的重點(diǎn)方向之一。2015年，美國(guó)哈佛大學(xué)的中美研究人員在美國(guó)《科學(xué)》雜志網(wǎng)絡(luò)版上發(fā)表報(bào)告說(shuō)，他們利用一種新的基因編輯技術(shù)，剔除了豬基因組中可能有害的病毒基因，從而攻克豬器官用于人體移植的一個(gè)重大難關(guān)，為需要器官移植的病人帶來(lái)希望。
這是因?yàn)樨i基因組中大約有11%的重復(fù)元件（PRE-1），這一比例與靈長(zhǎng)類動(dòng)物的重復(fù)元件副本幾乎相同。有研究人員在《自然》雜志上發(fā)表的研究報(bào)告稱，這些豬重復(fù)元件的結(jié)構(gòu)和功能非常類似于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的重復(fù)元件副本，暗示人類和豬之間存在比之前所認(rèn)為的關(guān)系親近得多。
現(xiàn)在，賴良學(xué)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)豬的基因進(jìn)行改造，獲得了多種免疫源性與人體更為接近的基因修飾豬，大大降低了人體異種器官的排斥反應(yīng)，讓異體移植距離臨床越來(lái)越近。
另外，他們也在探索利用基因編輯豬和多能性干細(xì)胞技術(shù)培育人體器官的可能性，“比如，胰臟的發(fā)育由一個(gè)關(guān)鍵基因控制，即PDX1基因，所以我們只需敲掉這個(gè)基因就可以讓豬不生長(zhǎng)自己的胰臟。再在胚胎期，將人全能性干細(xì)胞注射到早期發(fā)育的胚胎，理論上，生出來(lái)的豬的胰臟就全部來(lái)自于人的細(xì)胞，那么豬長(zhǎng)大后的胰臟與人的就可以匹配。”賴良學(xué)舉例說(shuō)。
這并非空穴來(lái)風(fēng)，2016年，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校的研究團(tuán)隊(duì)就正試圖透過(guò)向豬的胚胎注入人類干細(xì)胞，來(lái)培植出可供人體移植的器官，并希望這些“嵌合體”胚胎能為緩解世界移植器官緊缺問(wèn)題提供答案。
工具豬、培育人體器官的豬……這些都是賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)的研究?jī)?nèi)容，他將CRISPR/Cas9技術(shù)不斷加入自己的理解。“現(xiàn)在我的學(xué)生們已經(jīng)青出于藍(lán)，他們的討論總是能緊跟世界科技前沿動(dòng)態(tài)。”這讓賴良學(xué)更為激動(dòng)。
2016年，完成博士論文的王可品選擇留在了賴良學(xué)的團(tuán)隊(duì)，他希望未來(lái)可以利用大動(dòng)物基因修飾模型為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)作出更多貢獻(xiàn)。
來(lái)源：中國(guó)科學(xué)報(bào)
