發(fā)布日期：2017-10-10
2011年春天，加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna（詹妮弗·杜德納）教授前往波多黎各參加當(dāng)年的美國微生物學(xué)會年會。會議第二天下午她與好友John van der Oost 一起去一家咖啡廳喝咖啡，而正是在那里她遇見了一位穿著時尚的女科學(xué)家Emmanuelle Charpentier (艾曼紐·卡彭特)。詹妮弗大概怎么也不會想到，正是這一次相逢，改變了她的整個職業(yè)生涯。
詹妮弗第一次聽到CRISPR這個詞是2006年的時候。在與Jill Banfield教授的一次商議學(xué)術(shù)合作的通話中，Jennifer 聽到一個發(fā)音類似Crisper的東西，Jill并沒有解釋這個詞的含義，甚至連這個單詞怎么拼寫都沒提，她只是說想尋求該方面研究合作。Jill說CRISPR與RNAi之間可能存在著某種共性，而Jennifer課題組當(dāng)時主要的研究領(lǐng)域正是RNAi。Jennifer也非常爽快的答應(yīng)她下周在學(xué)校圖書館旁邊的咖啡廳見面商議合作的事宜。
當(dāng)天Jennifer來到那家咖啡廳的時候Jill早已在那里等候。她面前放著一個筆記本和幾篇論文。簡單的閑聊后她便開始在筆記本上畫起了草圖。
CRISPR序列 來源: Jennifer Doudna
這串由菱形和正方形構(gòu)成的區(qū)域便是CRISPR了。每一個菱形所代表的區(qū)域有著相同的堿基序列，而正方形區(qū)域的序列卻各不相同。Jennifer立即明白了CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，常間回文重復(fù)序列叢集）的含義。當(dāng)Jennifer問Jill該序列的功能時Jill回答：不是很清楚。她同時也說道大概有一半的細(xì)菌以及幾乎所有的古細(xì)菌基因組中都會存在該序列。很顯然如果該序列如此廣泛，它對細(xì)菌和古菌正常功能的維持也一定扮演著非常重要的角色。
接下來Jill拿出那幾篇論文，興奮地為Jennifer總結(jié)這幾篇論文所完成的工作。2005年三個獨立課題組均發(fā)現(xiàn)CRISPR重復(fù)序列間的間隔序列與某些噬菌體的DNA片段完全匹配，而且CRISPR中與噬菌體DNA片段匹配的數(shù)量越多，細(xì)菌受噬菌體感染的風(fēng)險也就越低。很明顯CRISPR可能是細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)的重要組分，用以防御噬菌體的侵入。最后，Jill給Jennifer看了Kira Makarova 和 Eugene Koonin等人發(fā)表的最新的一篇文章，該文章也提出了CRISPR的適應(yīng)性免疫功能的假設(shè)。
很長一段時間內(nèi)，Jennifer一直從事RNAi功能的研究，而現(xiàn)在看來CRISPR有著與RNAi相似的功能。對于Jennifer來說，CRISPR這一研究課題的誘惑力實在是太大了。并且她認(rèn)為當(dāng)時的時點對于她來說也非常有利：雖然已經(jīng)有人提出了關(guān)于CRISPR功能的理論，但并沒有人能夠完全驗證并且解析完整的作用機制，而她作為資深的分子生物學(xué)家做這方面的工作自然是得心應(yīng)手。
但Jennifer一時卻難以找到合適的人來做這方面的研究。Blake Wiedenheft的適時出現(xiàn)解決了她的難題。當(dāng)時Blake正申請前往Jennifer課題組做博士后研究工作。當(dāng)Jennifer問及他感興趣的研究方向時，Blacke回了一句：你聽說過CRISPR么？大概沒有比Blake更合適的人選了吧。
于是Jennifer組的CRISPR項目就這樣開始了。在Blake剛加入新實驗室不久時，丹麥的生物公司Danisco就已經(jīng)驗證了CRISPR的功能正是細(xì)菌的特異性免疫。隨即Stan Brouns等人報到了RNA在CRISPR系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用：CRISPR會先整體轉(zhuǎn)錄為RNA，再由酶剪切為具有單個重復(fù)序列/間隔序列的小片段，再與病毒DNA結(jié)合。而西北大學(xué)的Erik Sontheimer也發(fā)現(xiàn)了CRISPR RNA能夠通過DNA-RNA配對來誘導(dǎo)DNA降解。
Blake和Jennifer在為這些新發(fā)現(xiàn)感到興奮的同時，也認(rèn)識到仍有太多的基礎(chǔ)問題尚未解決。首先他們需要解析病毒DNA整合進入CRISPR序列以及CRISPR轉(zhuǎn)錄及RNA片段剪切的過程，其次他們也需要解析CRISPR RNA誘導(dǎo)病毒DNA降解的過程。于是他們將目光擴大到了CRISPR相關(guān)基因cas。
Cas基因 來源：Jennifer Doudna
cas基因的發(fā)現(xiàn)對于理解CRISPR功能具有重要貢獻。2002年Jansen首次在公開發(fā)表的文章中使用CRISPR這一名詞，通過生物信息學(xué)計算分析了CRISPR序列的特征并鑒定了4個CRISPR相關(guān)基因（CRISPR associated system, cas） cas 1-4。cas基因全都與CRISPR基因位點相鄰，提示兩者可能存在功能上的相關(guān)性。而且Cas蛋白同時具有螺旋酶和核酸酶結(jié)構(gòu)域，表明他們可能參與DNA代謝以及基因調(diào)控過程。
為了研究Cas蛋白的功能，Blake首先通過基因工程技術(shù)獲得了大量Cas1蛋白。在得到Cas1蛋白之后他通過一系列的實驗揭示了該蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)Cas1蛋白能夠剪切DNA片段以使病毒DNA序列能夠嵌入到CRISPR序列中。此時，Rachel Haurwitz也加入了該項研究，并參與了Cas 6的研究，確定了Cas 6的功能為剪切已轉(zhuǎn)錄的長鏈CRISPR RNA。之后他們解析了越來越多的Cas蛋白功能，但這些蛋白與Cas1或Cas6的蛋白功能都非常相似。
到了2011年，組內(nèi)的多位老成員也加入了CRISPR戰(zhàn)隊。此時Blake和Jennifer的興趣已經(jīng)逐漸由剪切CRISPR DNA/RNA的Cas蛋白轉(zhuǎn)向了剪切病毒DNA序列的Cas蛋白。他們與John組的合作研究卻發(fā)現(xiàn)剪切病毒DNA的過程極其復(fù)雜，需要多個Cas蛋白來靶向和剪切病毒DNA：首先CRISPR RNA會與大約10個Cas蛋白形成能夠靶向需要剪切的病毒DNA序列的復(fù)合體，緊接著Cas3會剪切目標(biāo)DNA序列。之后Jennifer又與其他組合作解析出了識別剪切序列復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，并確定了堿基配對在識別過程中的重要作用。而立陶宛的一個實驗室也確定了Cas3蛋白的剪切方式：Cas3并不是一次剪切完成，而是將其剪切為數(shù)百個DNA片段。
隨著研究的深入，科研人員也逐漸認(rèn)識到CRISPR系統(tǒng)的極高的多樣性。一般而言CRISPR系統(tǒng)被分為兩大類，六個組，19個亞組。而2011年之前Jennifer組的研究只集中于第一類，對于第二類CRISPR如何剪切DNA的，她卻知之甚少。此時的她進入了研究的瓶頸期。
II
2011年初，Jennifer在美國微生物學(xué)會年會上遇見了Emmanuelle Charpentier。當(dāng)John向她介紹Emma時，她立即想起了她的學(xué)生提到的Emma在瓦赫寧根的會議上關(guān)于tracrRNA的精彩報告。Emma從2000年初就一直對CRISPR很感興趣，她通過與馬普所的J?rgVogel合作對化膿性鏈球菌內(nèi)的小RNA進行測序，并發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌內(nèi)tracrRNA的含量異常豐富。通過生物信息學(xué)分析他們預(yù)計編碼該RNA的基因序列與CRISPR位點臨近，并推測其可能影響CRISPR的功能。之后的一系列實驗表明該系統(tǒng)具有三個組分：CRISPRRNA，Csn1蛋白，以及tracrRNA。
左：JenniferDoudna；右：Emmanuelle Charpentier
然而該系統(tǒng)的作用機制她卻并不清楚，與Jennifer合作會是她比較明智的選擇。Jennifer對這次合作感到非常興奮，此前她并沒有涉足過第二類CRISPR系統(tǒng)的研究，而這次的合作為她的工作提供了新的方向。她迅速指定組里的博后Martin Jinek，以及來自德國的碩士交換生Michael Hauer作為參與者，Emma組的博士生Krzysztof Chylinski也加入了該研究項目。
其實在第一次與Emma交談的過程中Jennifer就已經(jīng)意識到Csn1的重要作用。Csn1蛋白就是后來為人們熟知的Cas9。早在2007年Rodolphe和 Philippe等人就報道了Cas9能夠抵御嗜熱鏈球菌的病毒感染，Josiane 和 Sylvain等人的工作也發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白失活會影響病毒DNA的剪切過程。Emma的課題組則發(fā)現(xiàn)cas9基因突變會影響CRISPRRNA的生成，并導(dǎo)致整個免疫過程受損。Virginijus Siksnys等人的研究更進一步，他們發(fā)現(xiàn)Cas9是嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)中唯一起重要作用的Cas蛋白。越來越多的證據(jù)顯示Cas9在第二類CRISPR系統(tǒng)中病毒DNA剪切過程中具有非常重要作用。
然而如何解析該CRISPR體系的作用機制呢？很明顯，第一步是弄清楚Cas9的功能，與之前的工作類似，首先要做的是Cas9蛋白的提取和純化工作。Krzysztof把含有cas9基因的人工染色體寄給了Jennifer組，由她們組來完成該項任務(wù)。由于Martin此時正忙于尋找教職，他只能指導(dǎo)Michael完成蛋白的純化。但當(dāng)Michael將Cas9，CRISPRRNA以及相應(yīng)的病毒DNA混合之后，他卻發(fā)現(xiàn)Cas9無法剪切病毒DNA，而此時Michael在該實驗室交流的期限也到了，他只得悻悻的回到德國準(zhǔn)備畢業(yè)。
在Michael回國前夕，Martin終于在蘇黎世大學(xué)順利找到了教職并接替了Michael。他與Krzysztof順利找到了Michael實驗失敗的原因：tracrRNA的缺失。經(jīng)過夜以繼日的工作，Cas9剪切過程的全貌逐漸浮出水面：首先Cas9需要結(jié)合到病毒DNA上，并打開DNA的雙鏈?zhǔn)笴RISPRRNA能與DNA的一條單鏈進行堿基配對，配對成功則會誘導(dǎo)Cas9的兩個核酸酶功能模塊同時剪切兩條DNA單鏈，使DNA斷裂。隨著CRISPR RNA的變換，該系統(tǒng)幾乎可以剪切所有能夠與CRISPRRNA配對的病毒DNA序列。
那么Cas9能不能剪切除病毒DNA序列外的其他DNA序列呢？如果可以的話CRISPR將可能成為新的基因編輯工具。基因編輯領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有的基于TALE和鋅指蛋白的核酸酶有著嚴(yán)重的局限性。主要的問題在于蛋白與DNA序列的配對效率太過。而Cas9蛋白剪切只需要CRISPRRNA和病毒DNA序列的配對就能完成剪切，如果Cas9能夠作為基因編輯工具剪切其他類型的DNA序列，那么Cas9將會給基因編輯領(lǐng)域帶來革命性的變革。
為了簡化基因編輯系統(tǒng)，Martin將CRISPR RNA與TracrRNA連接形成一條嵌合RNA鏈。接下來為了驗證該系統(tǒng)的剪切病毒DNA之外的能力，他選擇了綠色熒光蛋白（GFP）中由20個堿基組成的5個不同序列，并且獲得了能夠與之配對嵌合RNA。在將RNA與Cas9和GFPDNA混合之后，不出所料，所有的GFP DNA都能在所設(shè)定的位點被完美的剪切。
2012年6月8日，Jennifer和Emma向科學(xué)雜志提交了論文，僅在二十天之后該文章就被接收?？v使她們很清楚這篇文章會對基因編輯領(lǐng)域產(chǎn)生巨大沖擊，她們也從不曾料想到CRISPR會掀起如此的驚濤巨浪。
III
Jennifer與Emma的文章為CRISPR作為基因編輯工具的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但該文章僅驗證了該系統(tǒng)剪切游離GFPDNA的能力，而CRISPR系統(tǒng)能否在細(xì)胞內(nèi)剪切DNA，成了另一個急需驗證的問題。于是Martin和Jennifer一刻也不敢停，立即開始了該方向研究。首先Martin將編碼Cas9和向?qū)NA的DNA序列分別轉(zhuǎn)入兩個質(zhì)粒中并將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)錄則能夠生成Cas9蛋白和向?qū)NA，并在細(xì)胞內(nèi)剪切DNA。由于已有研究表明ZFN可以在人胚胎腎細(xì)胞系HEK293成功編輯CLTA基因，因此他們選擇了同樣的基因，同樣的細(xì)胞，以便對比兩種基因編輯方式的優(yōu)劣。
然而早在Jennifer和Emma的文章發(fā)表之前，很多人就已經(jīng)預(yù)計到CRISPR的巨大潛力，這其中就包括張鋒和Geroge Church。張鋒出生于1982年，是哈佛-麻省理工布羅德研究所（Broad Institute of Harvard and M.I.T）最年輕的核心成員。他在斯坦福大學(xué)讀博士期間就幫助創(chuàng)建了光遺傳學(xué)工具，對神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了極為深遠(yuǎn)的影響。畢業(yè)之后，他回到了哈佛大學(xué)進行基因編輯的研究，并成為了首位使用TALE來控制哺乳動物基因的科學(xué)家。
2011年一位訪問學(xué)者去羅德研究所做報告，而報告的主題正是關(guān)于細(xì)菌中適應(yīng)性免疫相關(guān)的CRISPR。他坐在報告廳的后排，當(dāng)時他的思緒并沒有集中到報告的內(nèi)容上，但CRISPR這個聽起來有點奇怪的名詞卻激起了他的興趣。他此前從未聽過CRISPR，在上網(wǎng)搜索相關(guān)資料的時候他卻變得越來越興奮。聽完那場報告之后的幾天他就前往邁阿密參加一場學(xué)術(shù)會議，但他完全沒有心思聽會議報告，一直窩在酒店房間里瀏覽CRISPR的相關(guān)資料。
所幸當(dāng)時已公開發(fā)表的文章并不多。由于之前發(fā)現(xiàn)CRISPR能夠?qū)褂绊懰崮讨圃斓牟《?，所以?dāng)時的應(yīng)用研究大都集中在酸奶制造行業(yè)。但張鋒卻有一個大膽的想法：他希望把CRISPR應(yīng)用到人類細(xì)胞上。雖然繼續(xù)從事基因編輯工具TALE的研究對他來說失敗的風(fēng)險更小，但很顯然張鋒不是一個懼怕失敗的人。
左：張鋒；右：George Church
回所之后張鋒把他的想法告訴了他的學(xué)生從樂，而從樂立即明白了為什么張鋒對CRISPR感到如此興奮。此前他們使用的TALE需要繁瑣的蛋白合成過程，而且經(jīng)常合成完蛋白之后發(fā)現(xiàn)蛋白無法靶向到目標(biāo)DNA序列。但CRISPR不同，只需要RNA就能夠識別目標(biāo)DNA序列。如果說合成蛋白質(zhì)是建造一座摩天大廈，RNA的合成就像建造二層小樓那么簡單。
然而張鋒和從樂并沒有像Jennifer和Martin一樣從細(xì)菌開始研究，而是直接用人類和老鼠細(xì)胞做實驗。如果想為醫(yī)療行業(yè)帶來革新的話，他們必須證明CRISPR在這些細(xì)胞中的潛力。兩人開始瘋狂的工作。當(dāng)時他們兩人的目標(biāo)有兩個：證明CRISPR能夠編輯動物細(xì)胞基因組，以及編輯之后的基因組能夠產(chǎn)生預(yù)期的功能。他們同樣選擇編碼GFP蛋白的基因作為基因編輯的對象。如果編輯之后能產(chǎn)生綠色熒光的細(xì)胞越少，則會證明CRISPR成功編輯的細(xì)胞越多。
張鋒和從樂當(dāng)時沒有意識到競爭的存在。2012年6月Jennifer和Emma的文章上線，該文章驗證了CRISPR剪切游離DNA的能力，證明了CRISPR作為基因編輯工具的潛力。但張鋒并沒有因為這篇文章的出現(xiàn)而感到沮喪，因為剪切游離DNA與編輯動物細(xì)胞內(nèi)的基因組之間存在著巨大的差別。最后他們在Jennifer文章發(fā)表幾個月后完成了該課題的工作。2013年1月，張鋒組的文章在Science發(fā)表。他同樣也沒有意識到他之前的導(dǎo)師哈佛大學(xué)的George Church當(dāng)時也在做同樣的工作。George類似的工作也在同一期Science發(fā)表。
對于很多科學(xué)家而言知識產(chǎn)權(quán)的保護與發(fā)表文章同等重要。在2012年5月25日J(rèn)ennifer等人就提交了保護CRISPR技術(shù)的專利申請，七個月后的12月12日張鋒也提交了專利申請。由于申請了加快審核專利，張鋒在2014年4月第一個拿到了專利授權(quán)。2016年1月，Jennifer所在的加州大學(xué)要求對布羅德研究所的最早專利以及另外11項專利進行專利干涉，從而引發(fā)了著名的CRISPR專利大戰(zhàn)。最終這場專利之爭以布羅德研究所勝出告終。
但我想對很多人而言，最重要的不是誰搶先發(fā)表文章，誰第一個拿到專利，最終哪幾個人拿到諾獎，大多數(shù)人關(guān)心的是CRISPR技術(shù)究竟會為科研，醫(yī)療，甚至大眾生活帶來哪些影響。從某些層面來講，這正是CRISPR必須拿諾獎的原因。我們將在下半篇中對此進行詳細(xì)介紹。
為了闡明CRISPR是諾獎級成果這一問題，筆者在上半篇文章中已經(jīng)對CRISPR技術(shù)的基本概念和詳細(xì)發(fā)展過程做出了介紹，詳見：深度長文：為什么CRISPR必須拿諾獎？（上）。下半篇文章將會著重介紹CRISPR技術(shù)在各個領(lǐng)域中的應(yīng)用，并對相關(guān)上市公司進行簡單介紹。
IV
植物基因組編輯
2016年初，杜邦公司宣布要開發(fā)一種新型糯玉米的消息并沒有引起多少人注意。大家不知道的是，杜邦公司培育糯玉米的技術(shù)「CRISPR」正悄悄改變著整個育種行業(yè)。該公司運用CRISPR技術(shù)敲除了玉米中能夠編碼淀粉合成酶的糯質(zhì)基因wx1，從而使玉米中直鏈淀粉的含量減少、支鏈淀粉的含量增加，以此增加玉米的粘性。
自生命誕生以來的幾十億年內(nèi)，生命的演化過程一直遵循著達爾文的物種演化理論：通過隨機遺傳突變獲得生存、競爭和繁衍后代等方面的優(yōu)勢。但從農(nóng)耕文明開始人類就試圖改變外部世界，選擇性的培育更加優(yōu)良的動植物。早期的農(nóng)民通過隨機的品種或利用雜交獲得新品種，但這與自然進化過程類似，同樣依靠的是DNA的隨機突變。所以改良過程十分的緩慢，雖然經(jīng)過了數(shù)千年進展卻非常的小。
二十世紀(jì)初孟德爾的工作為植物育種奠定了科學(xué)基礎(chǔ)，并且為育種提供了可預(yù)測的框架。二戰(zhàn)之后隨著生物技術(shù)的發(fā)展又出現(xiàn)了新的育種方式，例如用甲磺酸乙酯、硫酸二甲酯等致突變劑，或者利用電離輻射或者轉(zhuǎn)座子等手段來誘導(dǎo)形成DNA突變，生成新的農(nóng)作物性狀。而現(xiàn)代育種學(xué)則更進一步，可以直接利用分子生物學(xué)手段對植物的基因組進行改造。比如通過基因重組向植物中引入特定基因形成轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。
但基因重組技術(shù)具有自身的局限性，例如難以準(zhǔn)確定位到基因組，或者進行基因的敲除或敲落。那么如何準(zhǔn)確定位基因組進行基因編輯呢？1996年約翰霍普金斯大學(xué)的Srinivasan Chandrasegaran課題組發(fā)現(xiàn)將具備基因組定位功能的鋅指蛋白 (Zinc finger protein) 和Fokl核酸內(nèi)切酶連接在一起，形成了能夠?qū)NA精切定位和切割的工具。但該技術(shù)存在很多的問題，其用于基因組定位的鋅指蛋白可編程性較差，設(shè)計和合成過程非常漫長。而且加州的Sangamo公司牢牢地把控著該項技術(shù)的專利，因此極大的限制了該項技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
十幾年之后出現(xiàn)了另一項編程性更強的基因組編輯技術(shù)TALEN，讓科學(xué)家們能夠快速、精準(zhǔn)的對基因組進行編輯。TALEN在2011年被Nature Method評為當(dāng)年的Method of the Year，然而TALEN僅僅風(fēng)光了一兩年，就淹沒在了CRISPR洶涌浪濤之下。
CRISPR被應(yīng)用于玉米育種(painting by Gregory Allen)
由于CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家能夠以前所未有的精確度來操控農(nóng)作物的基因組。其實CRISPR技術(shù)不只能夠讓育種專家更加便捷的獲得預(yù)期的作物性狀，還能被用于提高多種作物的抗病能力。CRISPR技術(shù)誕生短短幾年內(nèi)該技術(shù)就被應(yīng)用于編輯小麥基因組，使其能夠抵抗白葉枯病，使玉米，大豆，土豆能夠抵抗除草劑。2014年，中國科學(xué)院的科學(xué)家運用CRISPR以及TALEN技術(shù)同時修改小麥Mlo基因的6個基因拷貝，使其能夠抵抗白粉病。越來越多的作物正收益與CRISPR技術(shù)，使其具有更頑強的生命力。
與此同時，CRISPR對植物生物學(xué)研究的推進作用也是巨大的。長久以來科學(xué)家一直通過觀察自然界存在的天然突變，或者通過人工誘導(dǎo)隨機突變來探究作物中基因的功能。而CRISPR卻能夠以更加快速，更加高效的方式在基因中引入突變，破壞基因的編碼區(qū)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生功能異常的蛋白，以此探究基因的功能。除此之外，CRISPR還可用于靶向miRNA來激活或抑制特定植物基因的表達，或是基因的敲入、替換，甚至運用dCas9來調(diào)控植物基因轉(zhuǎn)錄等等。
V
動物基因組編輯
除了糧食作物，CRISPR技術(shù)也能夠?qū)π竽翗I(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，通過很小的基因組修飾會很大程度地提高養(yǎng)殖動物肉產(chǎn)量。而且與農(nóng)作物中的應(yīng)用類似，運用CRISPR技術(shù)可以很方便的同時修改動物多個基因，比如中國的科學(xué)家利用CRISPR同時修改肌肉生成抑制素基因MSTN和能夠控制毛發(fā)生長的生長因子基因FGF5，同時提高了山羊的肉產(chǎn)量和毛發(fā)質(zhì)量。
雖然CRISPR編輯的動物能夠推動畜牧業(yè)的發(fā)展，但實驗動物研究領(lǐng)域卻能最好的體現(xiàn)CRISPR技術(shù)的無限潛力。無論是用于病理研究還是新藥評價，實驗動物都對于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有著極其重要的意義。而實驗動物研究最基礎(chǔ)，最重要的是獲得可靠的動物模型，以此才能模擬人類發(fā)病的外在表現(xiàn)形式和內(nèi)在發(fā)病機制。
從上世紀(jì)初開始，小鼠就已成為生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的哺乳動物模型，現(xiàn)今已有超過三萬種小鼠品系，用于從癌癥到心血管疾病、失明等一系列疾病的研究。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)為小鼠模型的建立提供了高效，快速的技術(shù)手段。不僅適用于幾乎所有的小鼠品系，還能夠極大地縮短所需的時間，同時其成本也相對低廉，其成本僅為傳統(tǒng)基因工具的十分之一左右。
雖然小鼠動物模型的應(yīng)用廣泛，但其仍具有一系列局限性。對于諸如囊性纖維化、帕金森、阿爾茨海默病等疾病，它們通常無法表現(xiàn)出疾病的特征性癥狀，藥效評價中也可能出現(xiàn)非典型反應(yīng)。這就讓實驗室研究向臨床試驗研究轉(zhuǎn)化變得異常艱難。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)使非人靈長類動物模型的建立變得更加高效。
雖然十幾年前就可以通過病毒將外源基因轉(zhuǎn)入猴子基因組內(nèi)，但CRISPR技術(shù)出現(xiàn)以前科學(xué)家卻無法對猴子基因組進行編輯。在2014年初，南京大學(xué)模式動物研究所的黃行許將CRISPR注入單細(xì)胞胚胎，通過引入Ppar-γ和 Rag1 組合突變對食蟹猴的基因組進行精確的修飾，以此獲得了世界首只基因敲除猴。
CRISPR-Cas9 Horse Baby；by MichaelCammer
除了老鼠與猴，由于CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)豬也開始成為一種比較重要的動物模型。豬的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)與人有類似之處，器官大小與人類的相似，而且繁殖周期短、產(chǎn)仔數(shù)量多，所以也可以作為動物模型，但更加重要的是豬器官可能成為人類器官移植手術(shù)的重要來源。其實長久以來這一直是一些科學(xué)家的夢想，但由于技術(shù)的限制使它遙不可及。即使是人類之間的器官移植也可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，何況是異種之間移植。而且豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)的存在也是個很大的安全隱患。
CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)使我們向豬器官成為人類器官移植來源的追尋之路邁進了一大步。之前的技術(shù)主要是通過向豬基因組轉(zhuǎn)移人的某些基因來逃避免疫排斥過激反應(yīng)，但包括CRISPR在內(nèi)的基因編輯技術(shù)能夠直接敲除引起免疫反應(yīng)的基因，或者直接敲除PERVs基因。
2015年哈佛大學(xué)的GeorgeChurch和他的學(xué)生楊璐菡共同成立的eGenesis，希望運用CRISPR技術(shù)來實現(xiàn)豬人體器官移植的宏偉目標(biāo)。同年他們便實現(xiàn)了運用CRISPR同時敲除豬基因組內(nèi)PERVs基因的62個位點這一壯舉。之后他們又完成了另一項成就：獲得不含PERVs基因的小豬。他們首先在不觸發(fā)細(xì)胞凋亡的前提下大范圍敲出豬胚胎結(jié)締組織細(xì)胞基因組的PERVs基因，之后采用克隆技術(shù)將細(xì)胞核轉(zhuǎn)入豬卵細(xì)胞，發(fā)育形成胚胎之后移植入豬子宮內(nèi)并成功產(chǎn)下豬仔。
雖然豬器官的應(yīng)用未來還有很漫長的路要走，但CRISPR的無限潛力使我們更改更早的看到這一天的到來。因楊璐菡對醫(yī)療領(lǐng)域的貢獻，她入選了世界經(jīng)濟論壇評出的2017年度“全球青年領(lǐng)袖。
除了醫(yī)療領(lǐng)域相關(guān)的應(yīng)用，腦洞極大的GeorgeChurch也在進行一項知名度相當(dāng)高的項目：復(fù)活猛犸象。兩頭在大約兩萬年至六萬年前死亡的兩頭猛犸象標(biāo)本為其全基因組測序提供了可能。通過基因組分析可以得到猛犸象與現(xiàn)存的象的基因組變化，并發(fā)現(xiàn)了能夠編輯與體溫感知、皮膚和毛發(fā)發(fā)育，脂肪組織生成等過程相關(guān)的蛋白的1668個基因差異。George組在2015年運用CRISPR技術(shù)成功將現(xiàn)代象的其中14個基因替換為猛犸象的基因，但替換所有基因無疑會使一項非常浩大的工程，而且修改完之后的大象細(xì)胞并不一定能夠克隆并發(fā)育成為胚胎。(GeorgeChurch前幾年出版了一本書詳細(xì)解釋了他的這一宏偉目標(biāo)，此書腦洞極大，還包括如何合成人的“手性異構(gòu)體’’等研究項目)。
復(fù)活猛犸象 By NBC
除了以上這些應(yīng)用，科學(xué)家們也在利用CRISPR技術(shù)控制遺傳過程，修改子代的遺傳信息。這項技術(shù)被稱為Genedrive。在二倍體生物的有性繁殖過程中，后代從父母兩方分別獲得一組染色體拷貝，這也就意味著親代的基因 (selfish gene 除外) 有50%的可能性遺傳給后代。但運用Genedrive技術(shù)可以使遺傳信息傳遞方式改變。
主導(dǎo)這個項目的是GeorgeChurch (又是他) 組的Kevin Esvelt。這項技術(shù)的核心是基因的敲入，利用CRISPR技術(shù)對特定位點進行精確剪切并插入一段新的序列。而插入的該序列包含生成CRISPR基因編輯系統(tǒng)的的信息，所以它能夠自動的將自身拷貝到另一條染色體上，使子代的所有個體的染色體上都包含能夠編碼CRISPR系統(tǒng)的信息。
如果插入的序列不僅包含CRISPR信息，還包含其他信息，那么該信息也能夠在子代快速擴散。比如利用Genedrive在蚊子基因組插入瘧原蟲抗性基因，理論上在一段時間后該區(qū)域內(nèi)的所有蚊子將會全部攜帶瘧原蟲抗性基因。這會成為瘧疾疾病預(yù)防的重大進展。但很多科學(xué)家并沒有止步于此，他們設(shè)想的是在蚊子基因組插入雌性不育相關(guān)基因，使該基因在某些蚊子種群中像病毒一般快速傳播，導(dǎo)致該蚊子種群在此區(qū)域內(nèi)快速滅絕。
這會是一項非常可怕的技術(shù)，在實驗室的實驗過程科學(xué)家也應(yīng)該盡全力避免基因修飾過的蚊子擴散到外界。在釋放的過程中很難預(yù)料影響會擴散到多大的區(qū)域內(nèi)，而且如果使某些區(qū)域內(nèi)的蚊子快速滅絕，盡管有些科學(xué)家聲稱不會產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但個人覺得對生態(tài)的影響會很難預(yù)料，生態(tài)系統(tǒng)不會像一些模型預(yù)測的那么簡單。
除此之外，最重要的問題是如何預(yù)防該技術(shù)的惡意使用？Genedrive的設(shè)計并不十分困難，如果有人向蚊子的基因組中插入某些惡性基因，那么該技術(shù)會立即變成Gene Bomb (基因炸彈)。如何安全的使用該技術(shù)將會是一個非常大的問題。
VI
疾病治療
多種動物模型的臨床前實驗研究已經(jīng)證明了CRISPR在臨床前動物模型中的巨大潛力，也為疾病研究和藥物研發(fā)提供了重要的工具。但CRISPR技術(shù)能不能更加直接的被用來治療疾病呢？
2013年張鋒和GeorgeChurch實驗室證明CRISPR編輯人類細(xì)胞的可行性之后不到一年的時間，中科院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所的李勁松課題組就使用相同的基因編輯工具驗證其治療遺傳病的潛力。他們選擇了小鼠白內(nèi)障遺傳疾病模型進行研究，試驗中的模型小鼠攜帶顯性突變的Crygc基因能夠產(chǎn)生變性的晶狀體蛋白而發(fā)生混濁導(dǎo)致白內(nèi)障。結(jié)果CRISPR能從小鼠基因組的大約28億個堿基對中找到并修復(fù)突變。
研究人員設(shè)計了針對突變Crygc基因的導(dǎo)向RNA并直接將導(dǎo)向RNA和Cas9注入雜合子的受精卵中，之后發(fā)現(xiàn)有1/3的新生小鼠白內(nèi)障癥狀被治愈。而且治愈的小鼠可以通過生殖細(xì)胞將CRISPR-Cas9系統(tǒng)修復(fù)的Crygc基因傳遞到下一代。之后幾年科學(xué)家又用CRISPR治愈了小鼠的肌萎縮以及肝臟代謝相關(guān)疾病，并證明了該技術(shù)治療鐮狀細(xì)胞貧血癥，血友病，囊性纖維化，重癥聯(lián)合免疫缺陷等重大疾病的潛力。無論是核苷酸突變、缺失/增加，甚至是染色體異常CRISPR似乎都能勝任。
以上這些研究都為CRISPR技術(shù)直接應(yīng)用于人類遺傳病治療提供了安全性和有效性的初步驗證。當(dāng)然CRISPR的潛力遠(yuǎn)不止用于治療遺傳病，科學(xué)家們還在嘗試用基因編輯來阻止人體細(xì)胞免遭病毒感染，實際上在此之前第一個基因編輯臨床試驗正是為了治療HIV感染。除了傳染病領(lǐng)域，癌癥也是CRISPR技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域之一。
基因編輯 By Gloria Pizzilli
雖然基因編輯是一個非常強大的工具，但將動物實驗的成果轉(zhuǎn)化為臨床研究的勝利并不容易。過去幾十年基因治療所面臨的風(fēng)風(fēng)雨雨提醒我們醫(yī)學(xué)的進展遠(yuǎn)比我們想象的艱難?？茖W(xué)家面臨的第一個問題是靶細(xì)胞的選擇，體細(xì)胞還是胚胎細(xì)胞？
通過修改單細(xì)胞胚胎，其發(fā)育之后所有細(xì)胞的基因組將會被改變，其后代所遺傳的基因組也將會被改變，動物模型的實驗也證明了該策略的可行性。但該方法面臨著這嚴(yán)重的倫理問題。于是體細(xì)胞就成了大多數(shù)科學(xué)家的第一選擇。體細(xì)胞的基因組修飾無法遺傳給后代從而減少了倫理問題，但體細(xì)胞的基因組編輯遠(yuǎn)比生殖細(xì)胞論復(fù)雜的多，因此我們必須解決選擇體細(xì)胞做基因組編輯所帶來的新問題。
其中最大的問題是藥物的遞送問題。不同的疾病會影響不同的人體部位，比如亨廷頓氏舞蹈病主要影響腦內(nèi)神經(jīng)元，而鐮刀狀細(xì)胞貧血癥則影響紅細(xì)胞，囊性纖維化則主要影響肺部。選擇可及性比較高的體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)則是相對容易的方向。而循環(huán)系統(tǒng)的治療方式也有兩類：體內(nèi)基因編輯(in vivo) 和體外基因編輯 (ex vivo)。相對而言，體外的基因編輯方式更加簡便，而且有利于質(zhì)量控制。去年四川大學(xué)華西醫(yī)院的盧鈾團隊率先開展了世界首個CRISPR人體臨床試驗，敲除T細(xì)胞表面的明星分子PD-1。該團隊所采用的正是體外基因編輯的方式。
但并不是所有科學(xué)家的思路都與以上的方式相同，首先選擇采用體細(xì)胞的基因編輯。
2015年3月，5位學(xué)者在Nature聯(lián)名發(fā)表文章Don’t edit the human germ line (不要編輯人類生殖細(xì)胞，聽起來有點像三體監(jiān)聽員回復(fù)葉文潔的三句不要回答)，呼吁科研工作者謹(jǐn)慎使用基因編輯工具編輯生殖細(xì)胞基因組。但僅一個月后，中山大學(xué)的黃軍就組的文章上線，報道了使用CRISPR技術(shù)編輯86個無活性人類胚胎，以期修改能夠?qū)е碌刂泻Ｘ氀腍BB基因。雖然實驗的結(jié)果并不理想，但由于倫理問題該文章在國際上引起了巨大爭議。很多人擔(dān)心如果CRISPR被用于修改人類胚胎基因組來預(yù)防遺傳病，那么該技術(shù)將難以避免的被應(yīng)用于修改非醫(yī)學(xué)相關(guān)的基因問題。盡管如此，黃軍就還是被Nature雜志評選為當(dāng)年的年度十大科學(xué)人物。
編輯人胚胎：誰在扮演上帝的角色？(創(chuàng)世紀(jì)壁畫 by 米開朗基羅)
由于該文章所引發(fā)的巨大爭議，同年美國、英國和中國在華盛頓聯(lián)合組織了人類基因組編輯國際峰會，對人類基因組編輯的安全問題、倫理問題和政府監(jiān)管進行了討論。在這之后，胚胎基因編輯的倫理爭議似乎開始變得沒那么激烈，2016年瑞典和英國成為了中國之外的，允許胚胎進行基因編輯的另外兩個國家。
由于技術(shù)越來越成熟，該領(lǐng)域的研究和文章也越來越多。截止目前共有8篇人類胚胎編輯的文章發(fā)表，而其中5篇是在過去兩個月內(nèi)發(fā)表的。兩周前(9月22日) 黃軍就的另一篇文章上線，同樣是修飾HBB基因用于治療地中海貧血，但這一次使用的是克隆胚胎細(xì)胞，而且利用的是不具有剪切功能的CRISPR系統(tǒng) (且攜帶胞苷脫氨酶)進行堿基編輯，以修飾點突變。
毫無疑問運用CRISPR進行人胚胎基因組編輯能夠?qū)θ祟惣膊〉念A(yù)防產(chǎn)生巨大的影響，雖然現(xiàn)在的研究重點主要集中于體細(xì)胞基因組編輯，用以治療疾病，但隨著技術(shù)的不斷進步，CRISPR編輯生殖細(xì)胞的潛力會被進一步挖掘，倫理問題也可能因此得到比較好的解決。
VII
CRISPR相關(guān)生物技術(shù)公司
嗜熱鏈球菌能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為乳酸，所以常用于奶制品行業(yè)。丹麥的Danisco公司首先證明了嗜熱鏈球菌含有的CRISPR序列的功能是細(xì)菌的適應(yīng)性免疫，用以抵御噬菌體入侵（見：深度長文：為什么CRISPR必須拿諾獎？（上））。2011年杜邦公司收購了Danisco，并開始研究如何利用CRISPR抵抗噬菌體感染的嗜熱鏈球菌，更好的制造酸奶和奶酪。同年，Jennifer Doudna還在研究第一類CRISPR系統(tǒng)的時候，她就參與創(chuàng)立了Caribou Biosciences，希望運用CRISPR技術(shù)來簡化病毒檢測的過程。
Emmanuelle Charpentier在2012年也逐漸有了創(chuàng)立公司的想法。在Science文章上線的五個月后，她便與當(dāng)時還在賽諾菲任高管的老友Rodger Novak以及另一位風(fēng)險投資家的老友Shaun Foy討論CRISPR的商業(yè)潛力。一個月后Novak決定辭職共同創(chuàng)立一家新公司。之后三人開始積極尋找合作伙伴。
在與Jennifer交流之后他們計劃聯(lián)合George Church和張鋒共同創(chuàng)立這家公司，以期簡化之后可能存在的專利問題。但不幸的是，由于各種已知和未知的原因之后的商談極其不順利。在張鋒和Church文章發(fā)表的一年半以后，CRISPR技術(shù)已經(jīng)越來越成熟，資本強烈期望介入，成立公司的需求也越來越迫切。
CRISPR專利聽證會；來源： Science
但在知識產(chǎn)權(quán)、學(xué)術(shù)信譽、地理因素、媒體報道、諾貝爾獎、商業(yè)回報等一系列因素的考量下，對CRISPR技術(shù)做出巨大貢獻的四個人不僅沒有團結(jié)一致，反而開始分崩離析、各自為政。Jennifer和Emma二人組的關(guān)系也不像從前那么單純，變得越來越微妙。不僅個人的利益摻雜其中，加州大學(xué)、布羅德研究所、哈佛大學(xué)、麻省理工、維也納大學(xué)這幾個學(xué)術(shù)機構(gòu)的利益之爭也讓局面越來越復(fù)雜。
在此之后，Emmanuelle Charpentier, Rodger Novak, Shaun Foy, 以及Chad Cowan共同成立了CRISPR Therapeutics。張鋒，George Church, Jennifer Doudna共同成立了Editas Medicine。Erik Sontheimer, Luciano Marraffini, Derrick Rossi和 Rodolphe Barrangou共同成立了Intellia Therapeutics。而之后入局的其他公司則需要向以上這幾家公司和布羅德研究所支付高昂的專利授權(quán)費。
在2014年關(guān)鍵專利授權(quán)給張鋒之后一個月，Jennifer離開了Editas，加入Intellia。
VIII
寫在最后
我想現(xiàn)在已經(jīng)很難找到一個沒有聽說過CRISPR這個名詞的生物專業(yè)學(xué)生。短短幾年內(nèi)CRISPR技術(shù)已經(jīng)為基礎(chǔ)科研領(lǐng)域，和包括醫(yī)療健康以及農(nóng)業(yè)等與大眾生活更相關(guān)的領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。在科學(xué)的發(fā)展過程中，偶爾會有重大的進展出現(xiàn)，比如相對論，比如DNA雙螺旋，比如PCR技術(shù)，CRISPR雖然可能不能與以上的突破比肩，但其對科學(xué)發(fā)展的影響是毋庸置疑的。
Jennifer和Emma的工作為CRISPR作為基因編輯工具的誕生提供了基礎(chǔ)，而張鋒和Church兩人同時證明了CRISPR編輯哺乳動物細(xì)胞的巨大潛力。毫無疑問，這些人對于CRISPR技術(shù)的誕生與發(fā)展做出了重要貢獻。但如果沒有Jennifer，如果沒有Emma，或者沒有Church，沒有張鋒，CRISPR技術(shù)就不會出現(xiàn)了嗎？顯然不是(參見附錄的時間線)。
CRISPR能拿諾獎的實力爭議很小，但誰最后能夠拿到諾獎卻是個很大的謎團。科學(xué)界并不像人們想象的那樣單純，在利益和榮譽面前多數(shù)會變的不理性。在關(guān)于CRISPR的戰(zhàn)爭中，有人獲得了金錢，有人獲得了榮耀，有人開心，但也有人失落。
如果說CRISPR技術(shù)推動了科學(xué)的進展，使我們更加憧憬未來的美好生活，那么關(guān)于CRISPR技術(shù)的利益之戰(zhàn)和榮譽之爭，卻更讓我們理解了人的本性。
CRISPR Me by Michele Tragakiss
附錄：CRISPR時間線
CRISPR的發(fā)現(xiàn)與其功能
1987年，日本大阪大學(xué)石野良純第一次發(fā)現(xiàn)了CRISPR序列。
1993年，西班牙阿利坎特大學(xué)Francisco Mojica第一個確定現(xiàn)今被稱為CRISPR的位點。
2000年，F(xiàn)rancisco Mojica發(fā)現(xiàn)并報告了之前發(fā)現(xiàn)的該差別重復(fù)序列存在某些共同的特征（他在與RuudJansen的通信中使用過CRISPR這一名詞，后者在2002年在文章中正式使用這一名詞）。
2005年，F(xiàn)rancisco Mojica發(fā)現(xiàn)該序列與噬菌體基因組中的某些片段向匹配，并由此推測CRISPR屬于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。另一課題組也在同期獨立報道了類似的研究(Pourcelet al., 2005)。
Cas9與PAM的發(fā)現(xiàn)
2005年5月，法國國家農(nóng)業(yè)研究院（INRA）Alexander Bolotin, 在研究嗜熱鏈球菌的過程中發(fā)現(xiàn)了一個與眾不同的CRISPR位點(Bolotin et al., 2005)，該CRISPR系統(tǒng)缺乏之前熟知的cas蛋白基因，而還有其他未報到過的新cas蛋白基因，其中之一正是編碼后來被命名為Cas9蛋白的cas基因。而且他發(fā)現(xiàn)，與病毒DNA匹配的間隔序列一端均含有一個相同序列PAM(protospacer adjacent motif)，PAM是CRISPR目標(biāo)序列識別所必須的。
適應(yīng)性免疫假說
2006年3月，美國國家生物技術(shù)信息中心Eugene Koonin通過計算分析直系同源蛋白，并提出了CRISPR級聯(lián)為基于插入噬菌體同源DNA到間隔序列的細(xì)菌免疫系統(tǒng)的假設(shè)，摒棄了之前關(guān)于Cas蛋白作為DNA修復(fù)系統(tǒng)的假設(shè)(Makarovaet al., 2006)。
適應(yīng)性免疫功能的實驗驗證
2007年3月，Danisco公司Philippe Horvath試圖研究廣泛應(yīng)用于奶制品工業(yè)的嗜熱鏈球菌對于噬菌體的反應(yīng)。Horvath及其同事通過實驗發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)確實屬于適應(yīng)性免疫：將新的噬菌體DNA片段整合入CRISPR，并用以抵抗該類噬菌體的下一次攻擊(Barrangou et al., 2007)。他們還發(fā)現(xiàn)Cas9可能是使入侵噬菌體失活過程中唯一必須的蛋白。
間隔序列被轉(zhuǎn)錄為向?qū)NA
2008年8月，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)John van der Oost開始逐漸解析出CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾噬菌體入侵的過程。Johnvan der Oost 及其同事發(fā)現(xiàn)來源于噬菌體的間隔序列能夠轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)小RNA，成為CRISPR RNAs (crRNAs)，能夠引導(dǎo)Cas蛋白靶向目標(biāo)基因(Brouns et al., 2008)。
CRISPR如何作用于DNA靶標(biāo)
2008年12月，美國西北大學(xué)Luciano Marraffini 和 Erik Sontheimer發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)作用的靶標(biāo)是DNA而非RNA (Marraffini and Sontheimer, 2008)。由于人們一直以來都認(rèn)為CRISPR和RNAi具有類似的機制，這一發(fā)現(xiàn)讓研究人員感到意外。Marraffini和 Sontheimer 表示該系統(tǒng)如果能夠轉(zhuǎn)移到非細(xì)菌系統(tǒng)中，將可能開發(fā)成為強大的工具 (需要注意的是有的CRISPR系統(tǒng)可以靶向RNA (Hale etal., 2009)。
Cas9 剪切目標(biāo)DNA
2010年12月，加拿大拉瓦爾大學(xué)Sylvain Moineau及其同事發(fā)現(xiàn)可以靶向DNA并在精確位點（PAM上游三個核苷酸）引起雙鏈斷裂(Garneau et al., 2010)。他們同時確證Cas9是CRISPR-Cas9體系剪切過程所需的唯一蛋白、由單個蛋白（此處為Cas9蛋白）和crRNAs介導(dǎo)的干擾過程是第二類CRISPR系統(tǒng)的獨有特征。
Cas9 系統(tǒng)中tracrRNA的發(fā)現(xiàn)
2011年3月， Emmanuelle Charpentier課題組完成CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)干擾過程的機制解析的最后一塊拼圖。他們通過包含CRISPR-Cas9系統(tǒng)的產(chǎn)膿鏈球菌測序發(fā)現(xiàn)除了crRNA，尚存在第二個RNA，稱為tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA) (Deltcheva et al., 2011)。該RNA與crRNA形成雙鏈，并介導(dǎo)Cas9靶向DNA靶標(biāo)。
CRISPR 系統(tǒng)可以在異種生物中起作用
2011年7月，立陶宛維爾紐斯大學(xué),Virginijus Siksnys及其同事克隆了嗜熱球桿菌（含有第二類CRISPR系統(tǒng)）的整個CRISPR-Cas位點，并在大腸桿菌（不含有第二類CRISPR系統(tǒng)）中表達，并發(fā)現(xiàn)其能夠氣功質(zhì)?？剐?Sapranauskaset al., 2011)。以上實驗表明具有獨立的功能，而且第二類系統(tǒng)所需的組分都已發(fā)現(xiàn)。
Cas9介導(dǎo)的剪切過程解析
2012年9月，立陶宛維爾紐斯大學(xué) Virginijus Siksnys及其同事利用以上在大腸桿菌中表達的系統(tǒng)確證了Cas9的作用機制(Gasiunas et al., 2012)。他們確定了PAM的作用以及剪切位點，通過點突變發(fā)現(xiàn)RuvC結(jié)構(gòu)域能夠剪切非互補鏈，而HNH結(jié)構(gòu)域能夠剪切互補連。同時表明crRNA序列最少只需要20個核苷酸，更重要的是他們發(fā)現(xiàn)通過更改crRNA序列可以引導(dǎo)Cas9靶向?qū)?yīng)的DNA位點。
2012年6月，美國加州大學(xué)伯克利分校Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna與Virginijus幾乎同時報道了相同的發(fā)現(xiàn)(Jinek et al., 2012，該文章提交時間晚于Gasiunas等人文章)。但他們發(fā)現(xiàn)crRNA與tracrRNA能夠融合形成一條RNA，簡化了該系統(tǒng)。同時他們報道了運用該系統(tǒng)對GFPDNA進行剪切。
應(yīng)用CRISPR-Cas9 進行基因組編輯的驗證
2013年1月，哈佛-麻省理工布羅德研究所張鋒和哈佛大學(xué)George Church在同期的科學(xué)雜志報道了運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功進行真核細(xì)胞內(nèi)的基因組編輯。他們的研究表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠剪切人類以及老鼠細(xì)胞內(nèi)基因組的多個位點，并能引導(dǎo)同源重組修復(fù)。
來源：醫(yī)藥魔方數(shù)據(jù)（微信號 iyiyaomofang）
