發(fā)布日期：2017-09-06
頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分。比較常見的是甲狀腺腫瘤，喉癌、副鼻竇癌及各種口腔癌（如舌癌、牙齦癌、頰癌等：見圖1）。因此，頭頸部腫瘤的原發(fā)部位與病理類型居全身腫瘤之首。同時，頭頸部重要器官比較集中，解剖關(guān)系復(fù)雜，治療方法各異。據(jù)WHO評估，我國近年頭頸部腫瘤的年發(fā)病率為每10萬人中15.22人次（15.22/10萬），占全身惡性腫瘤的4.45%。按部位（圖2所示），頭頸腫瘤的發(fā)病依次為喉(32.1%)、甲狀腺(19.6%)、口腔(16.1%)、鼻咽(14.9%)、鼻腔副鼻竇(6.6%)、大涎腺(4.2%)、口腔(3.3%)、眼(1.52%)、下咽(1.5%)。在性別上，除甲狀腺腫瘤女性(14.2%)明顯多于男性(5.40%)外，其余以男性居多。其病因尚未查清，有人認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)；長期接觸有害的化學(xué)氣體及吸煙，亦為誘發(fā)因素之一。
圖1：頭頸部淋巴結(jié)與組織示意圖（源自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院頭頸部腫瘤放射治療圖譜）
圖2：頭頸部腫瘤病灶部位和頻率統(tǒng)計
循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從原發(fā)性實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放，突破血管從而進入外周循環(huán)血的腫瘤細(xì)胞。由于CTCs的稀有性，抗原異質(zhì)性而難以富集/捕獲，研究者早期主要致力于CTCs的富集與捕獲。目前CTCs已成為多種類型癌癥，如乳腺癌，肺癌，前列腺癌和結(jié)腸直腸癌對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價值。美晶醫(yī)療與寧波市第二醫(yī)院放化療科，李惠利東部醫(yī)院及寧波七院胃腸外科的臨床合作中對不能手術(shù)或不愿手術(shù)的局部進展期胃癌患者進行同步放化療,并觀察療效和不良反應(yīng),取得了較好的效果，發(fā)現(xiàn)CTCs在胃癌的預(yù)后評估及個體化治療，療效監(jiān)控等方面具有重要的臨床意義。但CTC在頭頸部腫瘤中的研究相對較少。本文主要從CTCs的特性、檢測手段及其在頭頸部腫瘤中的應(yīng)用進行概述。
1．循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特性與檢測手段
自1869年Ashworth首次報道外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell ,CTCs)的發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于CTCs的出現(xiàn)是”腫瘤轉(zhuǎn)移擴散“還是僅為原發(fā)病灶脫離的”單純腫瘤細(xì)胞“的問題已經(jīng)討論了近半個世紀(jì)之久。在過去的10數(shù)年，伴隨著分子病理學(xué)，免疫細(xì)胞組化等高敏技術(shù)的誕生，又重新燃起了CTCs臨床意義的研究熱潮。1996年Abati【3】等提出盡管外周血中僅有非常少的一部分CTC能存活下來并形成轉(zhuǎn)移灶，但是CTC的存在就可能為轉(zhuǎn)移額發(fā)生提供了基礎(chǔ)，且近年的許多研究證實CTC的出現(xiàn)與患者的預(yù)后呈正向相關(guān)，美國德州大學(xué)MD Adeson病院的Christfani等數(shù)個研究團隊證明，乳腺癌，結(jié)直腸癌患者CTC輔助臨床診斷可以作為一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。
腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶生長至發(fā)生轉(zhuǎn)移與其他惡性腫瘤往往經(jīng)歷原發(fā)灶的原位生長（原位癌）、突破基底膜成為浸潤癌、腫瘤細(xì)胞突破血管內(nèi)皮細(xì)胞從而進入血液循環(huán)、隨血液在全身播散的腫瘤細(xì)胞滯留于遠處器官的毛細(xì)血管、在轉(zhuǎn)移灶的定植和生長等惡性行為。在這一過程中，CTCs被認(rèn)為與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因其對腫瘤的早期診斷、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥監(jiān)測、預(yù)后判斷、開發(fā)新的治療靶點具有重要價值。2012年德國海德堡大學(xué)普外科臟器與移植專業(yè)的Steiner團隊在Langenbecks Arch Surg上發(fā)表的研究指出【4】，每克原發(fā)腫瘤灶或轉(zhuǎn)移灶每天約有106個CTC脫落進入外周血循環(huán)，而90%的CTC因為人體的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)和自身凋亡而失去活力，且CTC在外周血細(xì)胞中陽性率較低，與正常血細(xì)胞的比值約千萬分之一到億分之一之間。
目前CTCs檢測技術(shù)主要分為物理學(xué)模式（如以細(xì)胞大小差異和過濾為基礎(chǔ)的方法等），正向/負(fù)向篩選模式或借助微流控芯片（CTC-Chip）。作為中國自主研發(fā)的自動化循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)，美晶醫(yī)療CellRichTM循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)采用免疫納米磁顆粒并結(jié)合先進的微流體芯片設(shè)計專利技術(shù)對微量細(xì)胞進行捕獲和分析，是一種先進的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與分析平臺。該平臺具備正負(fù)向細(xì)胞篩選模式：在正向篩選模式中，通過將循環(huán)腫瘤細(xì)胞上的特異抗原與納米磁顆粒上的特異性抗體相結(jié)合，借助微流控專利技術(shù)使得含有腫瘤細(xì)胞的生物樣本通過梯度磁場，從而將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從血液或其他背景液中篩選出來。在負(fù)向篩選模式中，通過對生物體液樣本進行紅細(xì)胞裂解處理，配合使用與白細(xì)胞、紅細(xì)胞或血小板等特異性結(jié)合的免疫微珠等技術(shù)手段將循環(huán)腫瘤細(xì)胞之外的細(xì)胞進行去除，從而消除背景干擾對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進行檢測的技術(shù)手段。而此檢測技術(shù)開發(fā)完成后，將與現(xiàn)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)形成良好的互補和完善。更多細(xì)節(jié)詳見美晶醫(yī)療轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)4月刊的基于微芯片的自動化循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)?CellRichTM新型液體活檢平臺。其臨床檢測模式以iFISH（原位熒光雜交），免疫熒光及PCR法應(yīng)用較多，常見的有細(xì)胞角蛋白CK19；CK20；癌胚抗原（CEA）；Suivivin；Stanniocaclcin2；MicroRNA-21；各類人類染色體組（如CEP7,CEP8）等。目前，其在臨床應(yīng)用中最大的限制就是，缺乏特別明確的特異性標(biāo)志物，以上問題導(dǎo)致當(dāng)前CTC的研究停滯在原始階段，對CTC的單細(xì)胞特性、分子標(biāo)記物的種類及性質(zhì)的理解均不充分，距離臨床腫瘤病癥診療的轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍然有距離。
2．循環(huán)腫瘤細(xì)胞在頭頸部腫瘤中的應(yīng)用
頭頸部腫瘤與其它腫瘤（如乳腺癌，前列腺癌或結(jié)直腸癌）相比，過去一直認(rèn)為其預(yù)后主要取決于局部復(fù)發(fā)和區(qū)域性的淋巴轉(zhuǎn)移，其遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率僅在1%左右，因此關(guān)于CTC的臨床研究相對較少。然而伴隨著ICC（免疫熒光檢測），iFISH, PCR等高敏感，高特異性檢測技術(shù)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，又重新激起了對CTC臨床意義的研究興趣。近年許多研究證明CTC的出現(xiàn)不僅與患者的預(yù)后相關(guān)，還與腫瘤的組織學(xué)分級，腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況包括有無遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。Wollenbergtm，F(xiàn)unke，Pajonk【6】等團隊發(fā)表的多篇回顧性文獻對于頭頸部腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的共識是：1）20世紀(jì)90年代，Berget等采用傳統(tǒng)的酶免檢測（例如堿性磷酸酶（AP）；C26或EMA單抗的免疫熒光檢測（IF）；生物素-鏈酶親和素架橋的辣根過氧化物酶（AB-PCX)模式；生物素-鏈酶親和素架橋的堿性磷酸酶（AB-AP）模式等）幾乎很難檢測到目標(biāo)的CTCs（表1：酶免檢測在CTCs中的應(yīng)用（引用自：Funke I and Schraut W. J Clin Oncol. 1998 Feb;16(2):557-66.）；2）伴隨著分子病理學(xué)，免疫細(xì)胞組化等高敏技術(shù)的誕生，外周血模擬試驗中質(zhì)控細(xì)胞的捕獲率已可達到95%及以上（圖3：質(zhì)控細(xì)胞捕獲效率）；3）頭頸部腫瘤是一種全身性疾病，患者的遠處轉(zhuǎn)移往往發(fā)生在腫瘤分級的中后期，而且預(yù)示著不良的預(yù)后。因此認(rèn)為遠處轉(zhuǎn)移的早期診斷對頭頸部腫瘤的預(yù)后至關(guān)重要，且遠處轉(zhuǎn)利的高發(fā)生率與更短的生存期（OS)明顯相關(guān)（圖4：CTCs與預(yù)后的關(guān)聯(lián)：引用自：PLoS One. 2014 Aug 8）
近期寧波第七人民醫(yī)院副院長兼外三科主任郝敬鐸醫(yī)師近日在寧波市惠民計劃的贊助下，運用美晶醫(yī)療的CellRichTM新型液體活檢平臺對轉(zhuǎn)移性腫瘤（入組數(shù)十例結(jié)直腸癌，前列腺癌，乳腺癌及頭頸部腫瘤）患者實施CTCs檢測時發(fā)現(xiàn)，在早期腫瘤患者中，利用影像學(xué)還未發(fā)現(xiàn)病灶時已經(jīng)可以在外周血中檢測到CTCs。研究表明，在疾病的早期，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價值，也有助于轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)測和判斷；在疾病進展和治療過程中，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞能為動態(tài)檢測病情、耐藥性等臨床診療的關(guān)鍵因素提供重要信息，有助于醫(yī)師開展個性化的腫瘤治療。
3．循環(huán)腫瘤細(xì)胞在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用
頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma: SCCHN)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占頭頸惡性腫瘤的90%，占全身惡性腫瘤的10%。WHO統(tǒng)計，全球每年新增病例約65萬例，治療方式從單一手術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槭中g(shù)，放化療，分子靶向治療等多學(xué)科聯(lián)合模式，任然有50-60%的患者出現(xiàn)原位復(fù)發(fā)，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約有20%的患者發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，其5年生存率在50%左右，且近幾十年來沒有顯著提高。因此CTCs做為可評估HNSCC的早期檢測及預(yù)后的檢測指標(biāo)，而備受關(guān)注【7,8】。
2010年美國俄亥俄州國立兒童醫(yī)院頭頸部腫瘤外科Jatana團隊【9】對48例HNSCC術(shù)后患者的血液樣本進行CTCs計數(shù)分析，隨訪19個月后發(fā)現(xiàn)沒有檢測出CTCs的患者無病生存率明顯高于檢測出CTCs的患者，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。CTCs與患者年齡、性別、腫瘤位置（口腔、口咽、喉咽、喉）、腫瘤分期、是否加輔助治療均無相關(guān)性，認(rèn)為CTCs可以做為HNSCC預(yù)后不良的獨立危險因素。
其后意大利巴倫西亞大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)科的Grisanti研究組在2014年發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CTCs數(shù)量》2個時，HNSCC患者的預(yù)后比CTCs數(shù)量為0-1個的患者更差，患者的疾病無進展生存率與總生存率也更差。經(jīng)過治療后8%的CTCs陽性患者得到了控制（見圖5：化療前后CTCs數(shù)量變化與預(yù)后關(guān)聯(lián)）。該實驗結(jié)果刊登在2014年注明期刊Pos One【10】。
圖5：化療前后CTCs數(shù)量變化與預(yù)后關(guān)聯(lián)（引用自PLoS One.2014 Aug 8;9(8)）
入組的1位頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，化療前基線CTCs數(shù)量是3個CTCs，連續(xù)4個療程的化療后，CTCs數(shù)量上升到9個，同期實施的PET-CT所見顯示，在左腋下與脊髓部陰影明顯增加，預(yù)示腫瘤進展未得到控制。調(diào)整化療方案僅一個療程，CTCs數(shù)量從9個下降到5個，充分說明了CTCs即可以作為判斷HNSCC預(yù)后的指標(biāo)，又可以預(yù)測治療效果。（圖6）
圖6：CTCs的數(shù)量變化與影像學(xué)所見的聯(lián)合診斷，為修正患者治療方案提供參考意見（引用自PLoS One. 2014 Aug 8;9(8):e103918）
Bozec等【11】利用Cellsearch系統(tǒng)對49例Ⅲ／Ⅳ期ＨＮＳＣＣ患者進行研究時發(fā)現(xiàn)，治療前CTCs的檢出率為16%（8/49），NO患者的檢出率5%（1/19），N1-2C檢出率為23%（7/30），但腫瘤分級之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）。治療（單純手術(shù)或術(shù)后聯(lián)合放化療）６個月后，13例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，在這13例患者中有2例治療前檢出了CTCs，統(tǒng)計結(jié)果提示治療前與治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和CTCs的檢出沒有關(guān)系，同時研究還發(fā)現(xiàn)CTCs不但與患者的性別、是否有煙酒嗜好、腫瘤位置、腫瘤大小等無關(guān)，還與腫瘤的分化程度、腫瘤的分期均無關(guān)。但是CTCs數(shù)量的多少與患者預(yù)后及PFS，OS相關(guān)。
4.結(jié)語
綜上所述,基于外周血CTC檢測的對于頭頸部腫瘤臨床輔助診斷具有重要的臨床意義，其應(yīng)用前景廣闊，已成為當(dāng)前腫瘤臨床診療的研究熱點。CTC的富集模式主要有負(fù)向，正向，膜過濾與尺寸分離等模式，檢測診斷的主要方法是ICC，iFISH和PCR等。目前CTCs檢測的敏感性與特異性對于在其臨床應(yīng)用推廣是主要考慮因素，因此進一步提高CTCs檢測的敏感性，集成正負(fù)向等多種富集技術(shù)和高特異性生物標(biāo)志物檢測是下一代液體活檢技術(shù)的主要特征。通過連續(xù)觀察CTcs數(shù)量的變化情況和下游分析，為監(jiān)測腫瘤動態(tài)，早期發(fā)現(xiàn)/診斷腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，評估治療效果或調(diào)整治療方案，為個體化治療提供全面，實時的信息和新的診療思路。
寧波美晶醫(yī)療的CTC技術(shù)平臺的現(xiàn)狀及展望
國外的CTC檢測公司大部分都有自己獨立研發(fā)的檢測平臺或儀器，例如：Cynveniu公司的ClearID微流體平臺，F(xiàn)luxion Biosciences公司的基于微流體技術(shù)以及免疫磁珠的IsoFlux系統(tǒng)；寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司擁有一支經(jīng)驗豐富、創(chuàng)新能力強的研發(fā)、生產(chǎn)管理和市場推廣的人才隊伍。公司主要開發(fā)“精準(zhǔn)醫(yī)療”產(chǎn)品并提供相關(guān)服務(wù)。具體產(chǎn)品包括：：
醫(yī)療器械方面：自主研發(fā)的“CellRich?”循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells, CTC）檢測系統(tǒng)及配套試劑，用于檢測血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進行診斷和監(jiān)控癌癥病情發(fā)展。該系統(tǒng)已有8項發(fā)明專利獲得授權(quán)，20多項實用新型和軟件著作權(quán)授權(quán)。項目填補了國內(nèi)在CTC檢測儀器方面的空白，獲得了2014年“國家重點新產(chǎn)品”稱號。作為同類別中的首創(chuàng)產(chǎn)品，美晶醫(yī)療也牽頭制定了相關(guān)醫(yī)療器械分類標(biāo)準(zhǔn)（分類編碼6841）。目前“CellRich?”系統(tǒng)已經(jīng)在包括美國達特茅斯醫(yī)學(xué)院及上海胸科醫(yī)院在內(nèi)的國內(nèi)外多家知名醫(yī)院投入使用。
檢驗服務(wù)方面：滿足“精準(zhǔn)醫(yī)療”對基因檢測的需求，設(shè)立了美晶醫(yī)學(xué)檢驗所，已獲得衛(wèi)生部頒發(fā)的醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證書和臨床PCR實驗室資質(zhì)。目前美晶醫(yī)學(xué)檢驗所已開展臨床細(xì)胞分子遺傳學(xué)等檢驗服務(wù)，包括個性化用藥基因檢測，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，疾病風(fēng)險基因檢測等多項業(yè)務(wù)。業(yè)務(wù)范圍覆蓋華東，華南地區(qū)，已在上海，杭州等地設(shè)立了區(qū)域營銷中心。
液體活檢與醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷互補融合對于腫瘤精準(zhǔn)診療具有重要臨床意義， 隨著液體活檢技術(shù)的不斷成熟，快速精確篩選和分析血液中完整的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，由腫瘤細(xì)胞釋放出的外泌體，和循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）等生物標(biāo)記物，并與下游基因診斷相結(jié)合，將有力推動先進的分子診斷技術(shù)在個性化醫(yī)療中的應(yīng)用。
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作者簡介
樂飚博士：寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司研發(fā)總監(jiān)。日本名古屋大學(xué)工學(xué)博士，12年日本腫瘤臨床與研究經(jīng)歷，擅長基于納米技術(shù)的腫瘤早期診斷與治療的放射性醫(yī)藥品研發(fā)及分子診斷，曾獲得2001年度，日本生物工學(xué)學(xué)會第一屆優(yōu)秀論文獎等榮譽，入選2012年度上海市浦江人才，主持重大科研項目5項，參與或協(xié)助主持科研項目數(shù)十項，發(fā)表多篇SCI論文。
宋毅：寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司基因檢測服務(wù)部經(jīng)理。浙江師范大學(xué)理學(xué)碩士，7年的臨床基因檢測工作經(jīng)驗，目前主要帶領(lǐng)部門開展相關(guān)臨床檢測服務(wù)，及開發(fā)CTC下游基因檢測項目。
鄔振華：寧波市李惠利東部醫(yī)院胃腸外科副主任醫(yī)師，外科學(xué)碩士，1998年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)系，長海醫(yī)院普外研究生，長期從事胃腸外科臨床、科研工作。浙江省抗癌協(xié)會胃腸道間質(zhì)瘤專業(yè)委員會委員，寧波市胃腸道間質(zhì)瘤?？崎T診負(fù)責(zé)人，系中國癌癥基金會（索坦）、中華慈善總會（格列衛(wèi)）項目注冊醫(yī)師。
郝敬鐸：寧波第七醫(yī)院副院長，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，鎮(zhèn)海區(qū)“121人才”培養(yǎng)對象，鎮(zhèn)海區(qū)外科后備人才，鎮(zhèn)海區(qū)大外科質(zhì)控中心秘書，寧波市中西醫(yī)學(xué)會腫瘤分會委員，寧波市醫(yī)學(xué)會肛腸分會后備委員，曾赴上海腫瘤醫(yī)院、奧地利LKH醫(yī)院進修學(xué)習(xí)，能夠熟練將腹腔鏡技術(shù)融入到消化外科（胃腸、肛腸、肝膽胰）領(lǐng)域，對于各類腫瘤的綜合治療（化療、免疫、靶向）有獨到見解。多項科研課題獲廳局級、市區(qū)級立項，曾獲“寧波市優(yōu)秀團干部”“鎮(zhèn)海區(qū)十大杰出青年”“鎮(zhèn)海區(qū)科普大使”等榮譽。
沈挺博士：寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司總經(jīng)理，入選浙江省“千人計劃”。 作為主要項目及團隊負(fù)責(zé)人開發(fā)的“新一代癌癥血液檢測生物芯片及系統(tǒng)”項目，獲得了中國科技創(chuàng)業(yè)計劃大賽項目組一等獎，中國首屆創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽優(yōu)秀企業(yè)獎，寧波市首批市“3315計劃”海外高端創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新團隊最高獎A類，寧波市發(fā)明創(chuàng)新大賽獎，及國家科技部中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金的立項。本科畢業(yè)于清華大學(xué)自動化系，2004年獲美國斯坦福大學(xué)(Stanford University)管理科學(xué)與工程博士學(xué)位。具備豐富的工程技術(shù)研究，高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化和國際化企業(yè)管理的經(jīng)驗與背景。善于團結(jié)帶領(lǐng)團隊，整合資源，帶領(lǐng)公司不斷創(chuàng)新，開拓業(yè)務(wù)。
張曉晶博士：寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司董事長。入選國家第二批“萬人計劃” 科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，浙江省“千人計劃”，美國醫(yī)學(xué)和生物工程研究院院士（AIBME Fellow），獲得美國國立衛(wèi)生院（NIH）院長創(chuàng)新研究獎。畢業(yè)于美國斯坦福大學(xué)，回國創(chuàng)業(yè)前任美國著名常春藤盟校(Ivy League)之一的達特茅斯學(xué)院(Dartmouth College)正教授， 任生物醫(yī)學(xué)微納米型器件實驗室主任。學(xué)術(shù)休假期間，曾任美國美國斯坦福大學(xué)訪問教授，上海交通大學(xué) “王寬誠”講席教授。
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