發(fā)布日期:2017-02-28
IBS科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了迄今為止最小的CRISPR-Cas9家族成員,研究表明它可以通過腺相關(guān)病毒編輯突變致盲基因。
韓國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究所(Institute for Basic Science, IBS),韓國(guó)首爾大學(xué)等處的研究人員設(shè)計(jì)出了目前最小的CRISPR-Cas9,并通過腺伴隨病毒(AAV)將其遞送到了肌細(xì)胞和小鼠的眼睛里,用以編輯導(dǎo)致失明的基因。
這一研究成果發(fā)表在Nature Communications上,這種CRISPR-Cas9系統(tǒng)源自空腸彎曲桿菌(CjCas9),未來也許會(huì)成為一種有效治療一般疾病和“無藥可救”的疾病的新工具。
CRISPR-Cas9紅得發(fā)紫,作為“基因剪刀”蛋白,Cas9需要在導(dǎo)向RNA指引下在精確靶基因位置進(jìn)行切割。CRISPR-Cas9復(fù)合物要想到達(dá)靶標(biāo)DNA,就需要通過質(zhì)?;虿《具f送。IBS基因組工程中心主任KIM Jin Soo解釋說:“AAV是一種在體內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因的有效和安全的載體,已廣泛用于基因治療。”
天然狀態(tài)下,Cas9是細(xì)菌的免疫武器,切割可能損害細(xì)菌的病毒DNA。最常見的CRISPR-Cas9技術(shù)使用的是源自細(xì)菌化膿性鏈球菌的Cas9。然而這個(gè)蛋白由1,368個(gè)氨基酸組成,體積太大不能通過AAV包裝和遞送。即使科學(xué)家們將其分成兩部分,分別包裝在不同的病毒,也會(huì)出現(xiàn)其它的問題,如需要兩倍的病毒量,活性要比完整的Cas9小。金黃色葡萄球菌Cas9也可以用于基因編輯,且體積稍?。?,053個(gè)氨基酸),因此它可以通過AAV傳輸,但這種Cas9又沒有足夠的空間可以裝載其它蛋白。
在這項(xiàng)最新研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)CjCas9大小合適,而且高效,這個(gè)蛋白有984個(gè)氨基酸,可以與多個(gè)導(dǎo)向RNAs,還有熒光報(bào)告基因一同包裝進(jìn)AAV中。
為了利用細(xì)菌蛋白進(jìn)行基因編輯,研究人員優(yōu)化了這一技術(shù),他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)短的DNA序列,接在緊挨著Cas9靶向的DNA序列,即Protospacer Adjacent Motif(PAM)。每個(gè)不同的Cas9需要一個(gè)特定的PAM序列,否則就無法結(jié)合,并切割靶標(biāo)DNA序列。此外,研究人員還修改了導(dǎo)向RNA的長(zhǎng)度。
完成這種優(yōu)化后,研究人員將新的CRISPR-Cas9復(fù)合體,連同兩個(gè)導(dǎo)向RNA和熒光報(bào)告蛋白一起包裝到AAV中,朝著小鼠肌肉和眼睛中的突變基因傳遞。他們主要聚焦于涉及年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的兩個(gè)基因,這也是成年人失明的主要原因之一。
一個(gè)基因是ADM的常見治療靶標(biāo),稱為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF A),另一個(gè)基因是激活VEGF A的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子:HIF-1a。后者此前并未被當(dāng)作藥物靶標(biāo)。在這項(xiàng)研究中,研究小組證明CjCas9通過AAV傳遞到了視網(wǎng)膜,可以有效地使小鼠中的Hif-1a和VEGF A失活,并減少脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的面積。
KIM Jin-Soo解釋說:“CjCas9具有高度特異性,不會(huì)出現(xiàn)基因組中的脫靶突變。”
來源:生物通