發(fā)布日期：2017-02-21
引子
最近，Grail準備投資10億美元計劃招募7000初診癌癥和3000 健康人群，致力于腫瘤血檢早期診斷標記物的開發(fā)[1]。腫瘤血液檢測要爆發(fā)了嗎？
從技術外行和使用者的角度吐槽一下腫瘤液體活檢的進展和前景。拋磚引玉。
正文
腫瘤液體活檢與傳統(tǒng)組織活檢的優(yōu)劣勢比較
前年初參加腫瘤液體活檢會議的時候，還覺得它離實際應用還遠，F(xiàn)DA的指南也含糊其詞。一年多過去，已經(jīng)有多款液體活檢伴隨診斷產(chǎn)品獲FDA批準，或已經(jīng)得到眾多臨床數(shù)據(jù)，準備審報了。液體(血清) 活檢的發(fā)展真是可以用日新月異來形容。
液體活檢主要包括血液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs), cell-free DNAs (cfDNA), 外泌體（exosome）等。CTCs 火了幾年，在2013年到達高峰后發(fā)現(xiàn)應用有許多局限，被迅速崛起的cfDNA取代。外泌體發(fā)現(xiàn)還比較新，雖然發(fā)展迅速，但離應用還有距離。這里主要討論cfDNA的進展，主要是伴隨診斷和藥物療效實時跟蹤方面的應用。
血檢與組織檢測相比優(yōu)勢在于：方便，快速，即時，便宜，微創(chuàng)。
更重要的是，血檢能夠挽救許多組織樣品難以獲得 (when tissue is an issue)，或組織樣品數(shù)量、質(zhì)量不高的患者獲得靶向療法，或參與臨床研究的機會。比如，完成超過30,000臨床測試的Guardant Health報道，血檢方法挽救了高達50.2%的臨床患者的靶向突變基因的信息，這些患者要么組織樣品難以獲得，要么樣品質(zhì)量不高，沒有檢測到致癌突變。
不是所有腫瘤細胞都會將突變的碎片DNA釋放到血液中，不同種類的腫瘤的血檢檢出率也不一致。據(jù)Guardant Health的報道，肝癌檢出率最高，約為92%，非小細胞肺癌89%，最低的膠質(zhì)母細胞瘤檢出率只有57%。這是血檢的最大的限制性硬傷之一。也是組織活檢永遠都有價值的依據(jù)所在 (仍舊是金標準)。
血清cfDNA檢測還有許多其它挑戰(zhàn)性因素，比如：
·DNA片段小，50-200 bp（峰值165 bp）。
·半衰期短，30 分鐘，之后穩(wěn)定。
·低含量/豐度：低nM/mL 血清。
·隨著治療效果的增加，腫瘤DNA比例大幅減少。
·正常細胞DNA的污染。
血檢在非小細胞肺癌的應用
隨著技術的不斷進步，腫瘤血檢已經(jīng)取得巨大的成功。腫瘤血檢進展最快和最成熟的也是有著最迫切需求的是肺癌靶向療法的伴隨診斷。肺癌病人多，死亡率高，靶向藥物研發(fā)進展快。同時肺癌組織取樣困難，危險，容易誘發(fā)并發(fā)癥。肺癌臨床醫(yī)生和患者對血檢的需求是最積極的。
肺癌血檢進展最快的是EGFR敏感突變的檢測。EGFR突變在歐美人群占非小細胞肺癌的15%以上，是個比較多的患者人群。在國內(nèi)比例高達25%以上。FDA去年已經(jīng)批準了Roche的cobas血檢試劑盒用于一線EGFR突變的酪氨酸激酶小分子伴隨診斷 (2016-6-1)，以及二線三代AZD9291（TAGRISSO）的伴隨診斷 (2016-9-28)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的EGFR T790M陽性患者的數(shù)據(jù)，組織活檢得到的臨床試驗數(shù)據(jù)總體應答率（ORR）為62%，無進展生存期（PFS）為9.7個月，血檢的ORR為63%，PFS為9.7月。二者數(shù)據(jù)非常吻合[2]。血檢與組織活檢一致性也很高。許多其它的公司產(chǎn)品中都包含EGFR的突變檢測。
部分商品化血檢試劑盒匯總
阿斯利康 (AZD) 花費了大量的精力來檢測三代AZD9291的獲得性耐藥突變機制，最新的報告數(shù)據(jù)顯示約有20%的耐藥突變由C797S突變組成 (100 例患者數(shù)據(jù))，即突變了AZD9291的共價結(jié)合位點。這個比例比以前的報道要低[3]。期待后續(xù)的組織活檢數(shù)據(jù)報道，可以比較二者的一致性。其它的突變多為零散分布。同時，AZD也在檢測內(nèi)在 (原發(fā)) 突變機制，更多的數(shù)據(jù)在今年的AACR上應該有更新。
至于用NGS多組合(panel) 檢測，Guardant Health 在推出Guardant 360后，又進一步推出Guardian 500+, 與多個大型制藥公司合作，用于臨床檢測，篩選潛在的腫瘤相關突變基因。這與NCI正在進行的傘式（umbrella）和籃式（basket）臨床試驗的目標是吻合的。即大規(guī)模篩選患者人群的可靶向突變，推進，加速靶向藥物的使用和開發(fā)進程。當然，組合也不是越大越好，如果入選的突變基因不是驅(qū)動致癌突變，或者不可靶向，不能對治療提供診斷意義，意義或許不大，徒增成本。
NGS panel與PCR方法相比，代表了未來更先進的技術。當前，使用者用不同公司的產(chǎn)品得出的結(jié)果差異性還很大[4]。AZD的腫瘤轉(zhuǎn)化部門的VP Carl Barrett 甚至給出了幾種主流產(chǎn)品20%吻合率的值，令人大掉下巴。Barrett提到，正在用商品化的血清和組織樣品來比較不同公司的產(chǎn)品的可靠性，結(jié)果可能會在今年AACR年會上公布。看來，相比PCR的方法，NGS在血檢上還需要進一步繼續(xù)提高敏感性和一致性。
從輝瑞公布的ALK 融合突變3代ALK抑制劑Lorlatinib的血清cfDNA ALK突變臨床數(shù)據(jù)，我們能夠得到哪些有用的信息呢？他們用的是BEAMing dPCR 的方法[5]。明顯感到作者對方法的靈活性非常不滿，因為ALK的耐藥突變種類較多，得隨著臨床進展不斷調(diào)整PCR引物和反應條件。
從38例患者的血清cfDNA中，檢測到有14例患者有ALK耐藥突變。這個比例與以前報道的組織檢測數(shù)據(jù)相當。同時，ALK的突變種類，比例分布模式也與以前的報道類似。
血清活檢與以前的組織活檢相比，能夠檢測到更豐富的信號。腫瘤突變的異質(zhì)性再次得到驗證。以前組織檢查的結(jié)果，多數(shù)耐藥突變?yōu)锳LK單一突變，只有個別是雙突變。但血清檢測到的結(jié)果則顯示，有一半的患者的ALK耐藥突變等于或多于2個突變，最多的有4個突變。
Lorlatinib的ALK活性大幅提高，比一代ALK抑制劑Crizotinib的活性提高了20-50倍，臨床前數(shù)據(jù)表明，它能夠克服幾乎所有的ALK耐藥突變，特別對門控突變L1196M有極高的活性。但令人困惑地是，在所有包含L1196M的六例突變患者中，有三例屬于有效反應，另外三例效果不佳。根據(jù)以前的報道，效果不佳的患者，有很大的可能性是由于Src活性增加造成的內(nèi)在抗藥機制疊加引起的[6]。Src磷酸化活性增加難以用基因檢測的方法觀察到，只能借助蛋白組學的信息。這也從側(cè)面反映出基因檢測不是萬能的，還要與其它有效的方法借鑒，互補。
Lorlatinib的ALK耐藥突變有一例報道，即L1198F[7]。（血清活檢的結(jié)果中還沒有發(fā)現(xiàn)同樣的突變）這個新的耐藥突變不能被二代ALK抑制劑克服，卻對一代ALK抑制劑Crizotinib極其敏感，從而形成一個良性循環(huán) (loop) 用藥選擇，把惡性腫瘤轉(zhuǎn)化成可控制的慢性病。這應該是在發(fā)現(xiàn)最終治愈手段之前我們對靶向療法期望中理想的“小目標”了。
血檢在結(jié)直腸癌、腸胃癌上的應用
除了肺癌，晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）是血檢發(fā)展較快的。即KRAS突變的檢測。它不是用于KRAS本身的靶向（還沒有有效的直接靶向藥物，藥物化學家加油?。?，而是用來指導EGFR抗體用藥 (如cetuximab)，即有RAS野生型的患者對EGFR抗體有效，KRAS突變的患者效果不顯著。德國的Merck在這個方向最積極。與Sysmex合作開發(fā)OncoBEAM檢測儀器用于KRAS臨床伴隨檢測，與組織活檢的一致性達到>92%[8]。與Biocartis合作開發(fā)傻瓜型診斷一體化儀器（研究用）。只要把1mL血清加入到檢測儀器中，130 分鐘后自動出結(jié)果。號稱10歲的小孩就可以操作。
除了伴隨診斷，KRAS血檢還可以用于藥物治療效果跟蹤，指導用藥，停藥決定。如有報道的病例，EGFR抗體使用造成野生型的RAS發(fā)生突變，疾病進展后建議停止使用EGFR抗體，并使用其它治療方法，等KRAS突變檢測呈陰性后，可以繼續(xù)使用EGFR抗體。這些方便，靈敏，對患者友好的RAS突變狀態(tài)的動態(tài)監(jiān)測，正是血檢的優(yōu)勢所在，受到醫(yī)生患者的積極響應。
雖然KRAS突變在非小細胞肺癌中占的比例高達25%以上，但由于沒有有效的直接靶向KRAS的藥物可以使用，所以KRAS突變信息在肺癌患者中對治療的指導意義當前還很有限，好在腫瘤免疫療法對KRAS突變應答率還不錯。
最近在EORTC-NCI-AACR會議上報道的腸胃癌（GISTs）的一期臨床過程中，完美地應用了液體活檢的手段，跟蹤cKIT和PDGFR的耐藥突變動態(tài)變化。Imatinib（Gleevec）在CML有著耐久神藥的稱號，但在在腸胃的靶向突變上，卻很快就產(chǎn)生了耐藥突變。BLU-285和DCC-2618就是設計出來的二代，用來克服一代的耐藥突變。常規(guī)血樣液體活檢能夠及時，準確的追蹤臨床藥物的使用效果[9]。看來，以后靶向耐藥臨床試驗的液體活檢有逐漸要成為標準檢測之一的傾向。
血檢cfDNA的其它應用前景
隨著cfDNA技術的不斷進步和成熟，用常規(guī)血液cfDNA樣品來大規(guī)模篩查罕見驅(qū)動致癌突變獲得了很好的機會，比如TRKA, B, C 融合突變在幾乎大多數(shù)腫瘤類型中都有表達，但比例都不高[10]。這樣，即使有很好的TRK小分子抑制劑，因為病人招募非常困難，新藥開發(fā)進展緩慢。如果常規(guī)血檢panel能夠得到推廣，新藥臨床開發(fā)可以大大提速。其它的例子象在非小細胞肺癌，c-RET的融合突變有1-2%，c-MET 外顯子14剪切突變在肺癌有2-4%等，都是驅(qū)動致癌突變，卻因為病人數(shù)量相對較少，嚴重阻礙了小分子藥物臨床開發(fā)進展與獲批[11]。
乳腺癌中的PIK3CA 突變，黑素瘤中的BRAF（V600E）也是液體血檢的研究熱點。
用血清cfDNA的手段來檢測基因的過量表達還非常困難。很多時候，cfDNA的表達量與腫瘤組織相應蛋白表達含量不成正比。像乳腺癌的HER2檢測可能還要更多的依賴于傳統(tǒng)組織檢測手段。
至于許多其他的腫瘤類型，特別是致癌突變基因不明確，靶向藥物缺乏的情況下，血檢的重要性和迫切性還不是很明顯。
隨著腫瘤免疫療法臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，大規(guī)模的NGS血檢數(shù)據(jù)也許可以輔助預判免疫反應的概率，用來指導潛在的用藥組合。這應該是較為遙遠的目標。
最后，最具社會價值的應用之一是癌癥特別是肺癌的早期診斷了。肺癌總體5年生存率只有18%。如果能夠早期發(fā)現(xiàn)，一期的五年生存率高達45-49%，二期也有30%。三期14%，四期只有1% (美國癌癥協(xié)會網(wǎng)站統(tǒng)計，2000年的少有的早期數(shù)據(jù)，現(xiàn)在肺癌晚期生存率應該提高了很多，見[11])。由于肺癌屬于看不見，摸不著的腫瘤類型，同時早期發(fā)病時癥狀也不明顯，導致多數(shù)患者確診時已是晚期。腫瘤液體血檢早期診斷還處在起步階段，也是Grail要努力的方向。當然，潑冷水的也大有人在，批評他們好高騖遠，搞高大上全, 不如來點實在的[1]。我覺得這是一個有前景的方向，特別值得慈善基金投資。
結(jié)語
總之，腫瘤液體活檢給臨床醫(yī)生和患者提供了一個強有力的嶄新工具，隨著技術的不斷成熟，臨床成功案例的不斷積累，現(xiàn)在是時候討論腫瘤液體活檢的黃金時期了嗎？
Liquid biopsy, is it (are we) ready for prime time？
參考文獻
1. Grailto pour $1 billion into blood test to detect early cancer. Sheridan C. Nat Biotechnol. 2017, Feb 8;35(2):101-102.
2. EGFR mutation detection in cfDNA from NSCLC patient plasma: A cross-platform comparison of leading technologies to support the clinical development of AZD9291. Thress KS, et al. Lung Cancer. 2015, (3):509-15.
3. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Thress KS, et al. Nat Med. 2015, (6):560-2.
4. Detectionof therapeutically targetable driver and resistance mutations in lung cancer patients by next generation sequencing of cell-free circulating tumor DNA.Thompson, J. C. et al. Clinical Cancer Research. 2016, 22(23):5772-5782.
5. Felip, et al WCLC, 2016, abstract #5053.
6. Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer. Crystal AS, et al. Science. 2014, 346(6216):1480-6.
7. Resensitization to Crizotinib by the Lorlatinib ALK Resistance Mutation L1198F. Shaw AT, et al.N Engl J Med. 2016, 374(1):54-61.
8. Jones FS, et al, ASCO 2016, abstract #11538.
9. EORTC-NCI-AACR 2016, abstract #4LBA, 6LBA, 7LBA.
10. Targeting TRK family proteins in cancer. Khotskaya YB, et al. Pharmacol Ther. 2017 Feb 4.pii: S0163-7258(17)30020-7. [Epub ahead of print] Review]
11. 肺癌靶向藥物最新進展，2016-6-12, 醫(yī)藥研發(fā)社交平臺。
來源：醫(yī)藥研發(fā)社交平臺（微信號 DrugSNS）
